Новая технология делает мРНК-препараты точнее: ученые научились «отключать» их в ненужных клетках

Исследователи показали, что встроенные в молекулу мРНК регуляторные последовательности позволяют заранее определить, в каких клетках организма она будет работать, а где останется неактивной

Почему одной доставки мРНК уже недостаточно

После успеха мРНК-вакцин стало очевидно, что сама технология значительно шире профилактики инфекций. Сегодня на ее основе разрабатываются противоопухолевые вакцины, методы лечения наследственных заболеваний, аутоиммунных нарушений и даже способы временного производства терапевтических белков непосредственно в организме.

Но практически все подобные разработки сталкиваются с одной фундаментальной проблемой.

Липидные наночастицы (LNP), которые доставляют мРНК в клетки, распределяются по организму не идеально. Даже если препарат вводится в определенное место, часть молекул попадает в другие ткани. Там мРНК тоже может начать синтезировать белок, хотя это совершенно не требуется.

Для некоторых препаратов подобное «лишнее» производство белка лишь снижает эффективность. Для других оно способно увеличить риск нежелательных иммунных реакций или повреждения тканей.

Именно поэтому сегодня исследователи пытаются научиться управлять не только тем, куда попадает мРНК, но и где именно она начинает работать.

Вместо изменения наночастиц ученые изменили саму программу мРНК

Авторы новой работы предложили необычное решение.

Они не стали переделывать липидные наночастицы и искать новые способы адресной доставки. Вместо этого исследователи встроили в молекулу мРНК специальные участки — сайты связывания микроРНК (microRNA target sites, miRTs).

МикроРНК — это небольшие регуляторные молекулы, которые естественным образом присутствуют практически во всех клетках организма. При этом разные ткани имеют собственный набор микроРНК.

Этой особенностью исследователи и решили воспользоваться.

Если встроить в мРНК участок, который распознается определенной микроРНК, то в клетках, где эта микроРНК присутствует, синтез белка будет автоматически подавляться. В остальных тканях мРНК продолжит работать практически без изменений. Такой принцип давно обсуждался в молекулярной биологии, однако теперь его проверили применительно к современным мРНК-препаратам.

Как ученые проверяли идею

Работа включала несколько последовательных этапов.

Сначала исследователи изучили распределение различных микроРНК в тканях мышей и выбрали наиболее перспективные варианты.

Особое внимание уделили:

• miR-122 — характерной прежде всего для клеток печени;
• miR-142 — широко представленной в иммунных клетках.

После этого были созданы разные варианты мРНК с добавлением соответствующих сайтов связывания.

Для оценки работы системы использовали хорошо известные модельные белки, включая GFP (зеленый флуоресцентный белок), а затем перешли к более прикладным моделям, связанным с вакцинацией и клеточной терапией.

Такой подход позволял не только увидеть, где именно начинает работать мРНК, но и оценить влияние изменений на иммунный ответ.

Печень удалось практически исключить из числа активных тканей

Одним из наиболее впечатляющих результатов стало использование последовательности для miR-122.

После внутривенного введения обычной мРНК большое количество клеток печени активно синтезировало кодируемый белок.

Однако после добавления соответствующего регуляторного участка ситуация изменилась радикально.

Количество гепатоцитов, экспрессировавших белок GFP, уменьшилось примерно в 150 раз. При этом экспрессия сохранялась в других клетках печени, включая макрофаги и эндотелиальные клетки, то есть подавление оказалось именно клеточно-специфичным, а не общим отключением всей конструкции. Важно и то, что эффект сохранялся после повторных введений препарата.

Авторы отдельно оценили врожденный воспалительный ответ организма.

Несмотря на резкое снижение синтеза белка в гепатоцитах, уровни воспалительных маркеров практически не отличались от обычной мРНК. Это говорит о том, что изменения затронули именно экспрессию целевого белка, а не свойства самих липидных наночастиц или врожденную иммунную активацию.

Иммунные клетки тоже удалось «выключить» выборочно

Вторым важным направлением стала микроРНК miR-142, характерная для многих иммунных клеток.

Добавление соответствующих сайтов связывания практически полностью подавляло экспрессию мРНК в дендритных клетках, макрофагах и моноцитах, при этом не изменяя врожденную воспалительную реакцию после доставки препарата.

На первый взгляд такой результат выглядит неожиданным.

Ведь именно дендритные клетки считаются одними из главных организаторов иммунного ответа после вакцинации.

Именно здесь исследование подошло к своему самому интересному выводу, который меняет привычное представление о работе мРНК-вакцин.

Самый неожиданный вывод: дендритным клеткам необязательно самим производить антиген

Именно этот результат можно считать главным научным открытием исследования.

Классическая модель работы мРНК-вакцин выглядит достаточно просто. Липидная наночастица доставляет мРНК в антиген-презентирующую клетку, прежде всего в дендритную. Там синтезируется белок-антиген, который затем представляется Т-лимфоцитам, запускающим иммунный ответ.

Логично было предположить, что если запретить дендритным клеткам производить антиген, эффективность вакцинации заметно снизится.

Однако результаты оказались гораздо сложнее.

Когда исследователи практически полностью выключили экспрессию мРНК в профессиональных антиген-презентирующих клетках с помощью miR-142, антительный ответ практически не изменился. На модели GFP количество специфических CD8⁺-лимфоцитов действительно уменьшилось примерно вдвое, но полноценный иммунный ответ все равно формировался. А при использовании мРНК, кодирующей Spike SARS-CoV-2, статистически значимых различий в количестве Spike-специфичных CD8⁺ Т-клеток вообще обнаружить не удалось.

Гораздо важнее их способность получать уже готовый антиген от других клеток организма и затем представлять его Т-лимфоцитам. Именно этот механизм, известный как cross-presentation (перекрестная презентация), вероятно, играет значительно более важную роль, чем предполагалось ранее. Дополнительные эксперименты авторов также показали, что антиген, произведенный неиммунными клетками, эффективно передается профессиональным антиген-презентирующим клеткам.

Для разработчиков мРНК-препаратов это принципиальное изменение подхода. Если раньше основной целью считалось максимально эффективно доставить мРНК именно в дендритные клетки, то теперь становится очевидно, что столь жесткая адресность может оказаться необязательной.

Мышечная ткань оказалась активным участником иммунного ответа

Еще одним неожиданным результатом стало изменение представлений о роли мышечной ткани.

До настоящего времени место внутримышечной инъекции чаще воспринималось как удобная площадка для доставки препарата. Предполагалось, что основную работу затем выполняют иммунные клетки.

Авторы решили проверить и эту гипотезу.

Они использовали сайты связывания для мышечных микроРНК miR-133 и miR-206, практически выключив синтез антигена именно в мышечных волокнах.

Результаты снова оказались неожиданными.

После бустерной вакцинации количество Spike-специфичных CD8⁺ Т-клеток оказалось ниже, чем при использовании обычной мРНК. Кроме того, уменьшилось число клеток, содержащих гранзим B и маркер пролиферации Ki67, что указывает на менее выраженную функциональную активацию цитотоксических лимфоцитов. Одновременно исследователи обнаружили повышение экспрессии молекул MHC-I в мышечной ткани после введения мРНК и показали, что именно мышечные клетки служат одним из важных источников антигена.

Таким образом, мышца оказалась не пассивным местом введения препарата, а полноценным участником формирования клеточного иммунитета.

Почему печень может снижать эффективность мРНК-препаратов

Если роль дендритных клеток оказалась менее критичной, чем ожидалось, то значение печени, наоборот, оказалось значительно выше.

Липидные наночастицы хорошо известны своей склонностью накапливаться в печени. Для некоторых видов терапии это даже считается преимуществом. Однако для вакцин подобное распределение может иметь обратную сторону.

Печень относится к органам с выраженной иммунологической толерантностью. Ежедневно через нее проходят тысячи пищевых и микробных антигенов, поступающих из кишечника. Если бы иммунная система активно реагировала на каждый из них, хроническое воспаление стало бы неизбежным.

Поэтому в печени сформировалась особая иммунная среда, склонная скорее подавлять чрезмерную активацию Т-лимфоцитов, чем усиливать ее.

Авторы предположили, что именно этот механизм может мешать формированию сильного противоопухолевого иммунитета.

Эксперименты подтвердили гипотезу.

Когда экспрессию антигена в гепатоцитах блокировали при помощи miR-122, специфический CD8⁺-ответ становился более выраженным, а в опухолевой модели лимфомы A20 наблюдалось дополнительное снижение опухолевой нагрузки и накопление функционально активных цитотоксических лимфоцитов. При этом эффект исчезал после блокады рецептора PD-1, что указывает на участие пути PD-1/PD-L1 в формировании печеночной толерантности, хотя авторы подчеркивают, что этот механизм не является единственным.

Более точная экспрессия одновременно повышала и безопасность

Исследование показало еще один важный эффект.

Если в печени начинал синтезироваться белок, против которого уже существовали специфические Т-лимфоциты, сами гепатоциты становились объектом иммунной атаки.

В экспериментах обычная мРНК вызывала массивную инфильтрацию печени CD8⁺-лимфоцитами, повышение уровней АЛТ и АСТ, а также признаки апоптоза гепатоцитов. При использовании варианта с выключением экспрессии в печени эти изменения значительно уменьшались. Одновременно усиливалась экспансия антиген-специфических Т-клеток в селезенке. Аналогичная тенденция наблюдалась и в модели CAR-T-терапии, где ограничение экспрессии в гепатоцитах сопровождалось меньшим повреждением печени.

Таким образом, одна и та же инженерная модификация одновременно повышала эффективность клеточного иммунного ответа и уменьшала риск иммунного повреждения печени.

Что это меняет для всей платформы мРНК

Главная ценность исследования заключается не в создании новой вакцины против конкретной инфекции.

Авторы предлагают новый принцип проектирования мРНК-препаратов.

Первое поколение технологий было сосредоточено на оптимизации самой молекулы мРНК — ее стабильности, эффективности трансляции и снижении врожденной иммунной активации.

Следующим этапом стало совершенствование липидных наночастиц, позволяющих направлять препарат в определенные органы.

Новая работа добавляет еще один уровень управления.

Теперь становится возможным разделить два процесса, которые раньше считались неразрывными: доставку молекулы и место ее реальной работы.

Липидная наночастица по-прежнему может попасть сразу в несколько тканей, но встроенные сайты связывания микроРНК определяют, где синтез белка будет разрешен, а где автоматически подавлен.

По сути, разработчики получают возможность программировать пространственную экспрессию терапевтического белка уже после доставки препарата.

Именно поэтому результаты исследования выходят далеко за пределы вакцинологии. Такой подход потенциально может использоваться при создании противоопухолевых вакцин, in vivo CAR-T-терапии, заместительной белковой терапии и других мРНК-препаратов, где точность экспрессии не менее важна, чем сама доставка.

Ограничения исследования

Несмотря на высокую значимость результатов, авторы подчеркивают, что большинство экспериментов выполнено на мышиных моделях с использованием конкретной системы липидных наночастиц. Пока неизвестно, в какой степени аналогичные закономерности сохранятся у человека и будут ли одинаково работать при использовании других LNP-платформ. Поэтому исследование следует рассматривать как важное доказательство концепции, а не как готовое решение для клинической практики.