Как сигналы сердечных клеток меняют клетки костного мозга

Клетки костного мозга получили свойства кардиомиоцитов — но до восстановления сердца еще далеко

Вместо пересадки готовых клеток — попытка передать им биологические инструкции

После инфаркта часть сердечной мышцы погибает и постепенно замещается рубцовой тканью. В отличие от кожи или печени, взрослый миокард обладает крайне ограниченной способностью восстанавливать утраченные мышечные клетки. Современное лечение снижает нагрузку на сердце, предупреждает повторные сосудистые события и замедляет развитие сердечной недостаточности, но не возвращает погибший участок мышцы в исходное состояние.

Поэтому регенеративная кардиология многие годы ищет способ создать новые кардиомиоциты — клетки, которые сокращаются, проводят электрическое возбуждение и работают согласованно с остальной сердечной тканью.

Один из подходов основан на индуцированных плюрипотентных стволовых клетках, или иПСК. Это обычные зрелые клетки, которые сначала возвращают в состояние, близкое к эмбриональному, а затем направляют по нужному пути развития. Из иПСК уже научились получать кардиомиоциты для моделирования болезней, испытания лекарств и экспериментального восстановления миокарда.

Но технология остается сложной. Перепрограммирование требует строгого контроля качества, а полученные кардиомиоциты часто сохраняют незрелый, похожий на внутриутробный фенотип. При лечебной трансплантации необходимо также учитывать риск аритмий, неоднородность клеточной популяции, возможное сохранение недифференцированных клеток и трудности интеграции трансплантата в сердце.

Группа специалистов МФТИ, МОНИКИ им. М. Ф. Владимирского и НМИЦ им. ак. Е. Н. Мешалкина выбрала другой путь. Исследователи попытались не создавать новые иПСК из клеток каждого пациента, а использовать уже дифференцирующиеся иПСК-кардиомиоциты как источник биологических сигналов.

Кардиомиоциты оставили в среде молекулярную «инструкцию»

Клетки постоянно обмениваются сигналами с окружением. Они выделяют белки, факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса, липиды и внеклеточные пузырьки, которые могут менять поведение соседних клеток. Такое воздействие называют паракринным.

Если клетки некоторое время выращивают в питательной жидкости, часть выделенных ими молекул остается в ней. Получается кондиционированная среда — не просто раствор питательных веществ, а смесь биологических сигналов, отражающая состояние клеток в момент сбора.

Авторы работы использовали среду от кардиомиоцитов, полученных из иПСК и находившихся на 20-м дне дифференцировки. Затем в эту среду поместили мезенхимальные стромальные клетки, выделенные из красного костного мозга пациентов, которым проводили операции на открытом сердце.

Мезенхимальные стромальные клетки способны размножаться в культуре, участвуют в регуляции иммунных реакций и при определенных условиях могут давать начало костной, хрящевой и жировой ткани. Их часто называют мезенхимальными стволовыми клетками, хотя термин «стромальные» точнее отражает неоднородность такой клеточной популяции.

Главная идея состояла в том, что созревающие кардиомиоциты уже выделяют согласованный набор молекул, необходимый для формирования сердечного фенотипа. Вместо того чтобы по отдельности подбирать все сигналы для каждой линии клеток пациента, исследователи попытались воспользоваться готовой биологической средой.

При этом метод нельзя считать полностью свободным от химической индукции. Помимо кондиционированной среды, протокол включал фактор роста фибробластов, активин A, костный морфогенетический белок BMP4 и ингибитор сигнального пути Wnt IWP2. Новизна заключается прежде всего в отказе от генетического вмешательства и в использовании естественного секрета кардиомиоцитов как центрального компонента направленной дифференцировки.

Формы и белков оказалось недостаточно — клетки проверили электричеством

Заявить о превращении клетки в кардиомиоцит только по ее внешнему виду нельзя. Сердечная клетка должна обладать организованным сократительным аппаратом, управлять движением кальция, генерировать электрический потенциал и передавать возбуждение соседям.

Авторы использовали несколько независимых методов проверки.

После дифференцировки часть клеток стала более вытянутой и приобрела поперечную исчерченность. Она возникает благодаря упорядоченному расположению саркомеров — повторяющихся структурных единиц, обеспечивающих сокращение мышечной клетки. Иммунофлуоресцентное окрашивание выявило α-актинин, один из белков саркомерного аппарата.

При оптическом картировании исследователи обнаружили спонтанные кальциевые колебания. Повышение концентрации кальция внутри кардиомиоцита связывает электрическое возбуждение с сокращением: электрический сигнал открывает ионные каналы, кальций запускает взаимодействие сократительных белков, после чего удаляется из цитоплазмы и позволяет клетке расслабиться.

Средняя продолжительность угасания кальциевого сигнала у регулярно активных клеток составляла около 283 миллисекунд. Этот показатель оказался близок к результату иПСК-кардиомиоцитов, чья среда использовалась для индукции.

Еще более важные данные дал метод патч-кламп, позволяющий регистрировать токи через отдельные ионные каналы клеточной мембраны. У дифференцированных клеток появились быстрый натриевый, кальциевый L-типа и калиевый токи. В обычных мезенхимальных клетках контроля таких функциональных токов не обнаружили.

Натриевый ток обеспечивает быстрое начало электрического импульса, кальциевый поддерживает его и связывает возбуждение с сокращением, а калиевый возвращает мембрану к исходному состоянию. Вместе эти токи формируют основу потенциала действия сердечной клетки.

Полученные клетки также выращивали совместно с монослоем иПСК-кардиомиоцитов. Через 26 дней кальциевые сигналы распространялись по общей культуре синхронно. Это указывает на функциональную связь между клетками, хотя конкретный механизм контакта — например, образование щелевых соединений с участием коннексинов — авторы не исследовали.

Главный результат ограничивает низкая доля успешно изменившихся клеток

Работа показывает, что мезенхимальные клетки костного мозга способны под действием соответствующей среды приобрести сразу несколько признаков кардиомиоцитарного фенотипа. Но масштаб результата существенно скромнее, чем может показаться из формулировки «клетки превратились в сердечные».

Спонтанные кальциевые сигналы обнаруживались в среднем у 2,3% клеток. Поперечная исчерченность и α-актинин выявлялись примерно у 7,7%. Разница объяснима: присутствие структурного белка еще не означает, что клетка стала электрически активной и функционально связалась с соседями.

Электрофизиологические измерения также проводились на небольшом числе клеток. Натриевый и кальциевый токи удалось оценить только в трех клетках для каждого показателя, потенциал действия — в четырех. Такие данные подтверждают принципиальную возможность приобретения нового фенотипа, но не позволяют надежно описать его стабильность и вариабельность.

Особенно важно, что детальные опыты по дифференцировке были выполнены на мезенхимальных клетках одного выбранного пациента. Образцы костного мозга получили у 18 человек, однако расширенный анализ остальных участников в основном касался скорости роста исходных клеток. Поэтому заявление об устранении необходимости индивидуальной настройки пока остается гипотезой, которую нужно проверять на множестве независимых линий.

Авторы не анализировали состав кондиционированной среды. Предполагается, что в ней присутствовали сигналы путей Wnt, TGF-β и BMP, белки внеклеточного матрикса и, возможно, внеклеточные пузырьки. Но какие именно молекулы оказались необходимыми, в каких концентрациях они действовали и насколько состав отличался между партиями, исследование не установило.

Наконец, полученные клетки оставались незрелыми. Плотность ионных токов была ниже, чем у кардиомиоцитов взрослого сердца, а электрические показатели частично пересекались с характеристиками исходных мезенхимальных клеток. Для дальнейшего созревания могут потребоваться более длительное культивирование, механическая нагрузка, электрическая стимуляция, трехмерная тканевая среда и оптимизированный обмен питательных веществ.

Ближайшее применение находится не в операционной, а в лаборатории

Наиболее реалистичная ценность метода связана пока не с пересадкой клеток после инфаркта, а с созданием экспериментальных моделей.

Полученные из клеток конкретного пациента кардиомиоцитоподобные клетки можно потенциально использовать для изучения индивидуальных особенностей электрической активности, проверки действия антиаритмических веществ и оценки возможной кардиотоксичности новых лекарств. Такой подход особенно интересен, если он окажется воспроизводимым для людей разного возраста, с различными сопутствующими заболеваниями и неодинаковым состоянием костного мозга.

Однако низкая эффективность дифференцировки пока ограничивает даже фармакологический скрининг. Для тестирования препаратов нужны достаточно крупные и однородные клеточные системы, способные формировать стабильные проводящие участки. Популяция, в которой функциональные признаки имеют лишь несколько процентов клеток, может давать нестабильные результаты.

Потенциальное использование для восстановления миокарда требует еще более строгой проверки. Необходимо установить, выживают ли такие клетки после введения в поврежденную ткань, формируют ли сократительную силу, подключаются ли к электрической системе сердца и не создают ли очаги аритмии. Потребуются исследования на животных, оценка дозы и способа доставки, длительное наблюдение, стандартизация производства и регуляторный контроль.

Аутологичное происхождение, то есть получение клеток из организма самого пациента, действительно может уменьшать риск иммунного отторжения. Но оно не гарантирует безопасности. Клеточная обработка меняет свойства материала, а сердечная ткань особенно чувствительна к неоднородности электрической проводимости.

Ни FDA, ни другие ведущие регуляторы пока не рассматривают подобные лабораторные технологии как одобренное лечение инфаркта или сердечной недостаточности. Даже более зрелые направления клеточной кардиологии сталкиваются с трудностями при подтверждении устойчивой клинической пользы. За два десятилетия исследований мезенхимальные клетки в целом продемонстрировали приемлемую безопасность во многих испытаниях, но результаты по улучшению насосной функции сердца и долгосрочным исходам остаются неоднородными.