Почвенные бактерии скрывали молекулы, способные подавлять связанный с раком фермент

Ученые открыли миксоглюкамиды — новый класс природных соединений, которые воздействуют на белок AKR1C3. Но между подавлением фермента и лечением опухоли остается большая дистанция.

Две взаимосвязанные работы немецких ученых из Центра инфекционных исследований имени Гельмгольца (HZI) и Института фармацевтических исследований Саарланда (HIPS), опубликованные в журнале Angewandte Chemie International Edition, описывают новую группу природных веществ — миксоглюкамиды (myxoglucamides). Исследователям удалось не только обнаружить эти соединения и воспроизвести их синтез, но и установить, с каким человеческим ферментом они взаимодействуют.

Речь пока не идет о готовом противоопухолевом лекарстве. Значение открытия в другом: ученые нашли новый химический каркас, способный избирательно воздействовать на биологическую мишень, которую уже изучают в онкологии.

Почему бактерии производят вещества, которых ученые раньше не видели

Микроорганизмы способны создавать огромное разнообразие химических соединений. Некоторые помогают им защищаться от конкурентов, взаимодействовать с другими бактериями или приспосабливаться к окружающей среде.

Но существует принципиальная трудность. Наличие у бактерии генов, необходимых для производства определенного вещества, еще не означает, что она будет его вырабатывать в лаборатории.

Многие участки бактериального генома, отвечающие за синтез сложных молекул, при стандартных условиях выращивания остаются практически неактивными. Поэтому исследователь может изучить микроорганизм, проанализировать все обнаруженные вещества и так и не узнать, на что в действительности способна его биохимическая система.

Именно с этой проблемой столкнулись ученые, работавшие с почвенной миксобактерией Cystobacterineae sp. MCy9003.

Они обнаружили в ее геноме необычную группу генов, обозначенную mxg. Такие группы называют биосинтетическими генными кластерами: они содержат инструкции для производства ферментов, которые последовательно собирают сложное химическое соединение.

Чтобы выяснить, что именно кодирует найденный кластер, исследователи изменили регуляторный участок ДНК, управляющий работой этих генов. После их активации бактерии начали вырабатывать вещества, которые ранее не удавалось обнаружить.

Так были идентифицированы первые четыре миксоглюкамида — A, B, C и D. Последующие эксперименты позволили получить и охарактеризовать дополнительные варианты.

Миксоглюкамиды объединяют три класса биологических молекул

Особенность новых соединений заключается в их химическом строении.

Миксоглюкамиды относятся к гликолипопептидам. Это означает, что внутри одной молекулы объединены три типа компонентов: сахарный фрагмент, жирнокислотная цепь и часть, построенная из аминокислот.

Каждый из этих элементов выполняет собственные химические функции. Их сочетание определяет пространственную форму молекулы, ее взаимодействие с окружающей средой и способность связываться с другими веществами.

Однако ученых заинтересовало не просто наличие трех компонентов. В миксоглюкамидах обнаружили необычный аминокислотный фрагмент, содержащий винильную группу и дополнительные кислородсодержащие химические группы. Подобная комбинация ранее не была описана для природных продуктов.

В первом исследовании команда под руководством Рольфа Мюллера и Чэнчжана Фу проследила, как бактерия создает этот фрагмент.

Выяснилось, что его исходным материалом служит глутаминовая кислота — обычная аминокислота, которая затем подвергается серии химических превращений.

Здесь обнаружилась еще одна необычная особенность.

Один из ферментов способен начать модификацию аминокислоты самостоятельно, но завершение процесса тесно связано с присоединением жирнокислотной части растущей молекулы. Два этапа биосинтеза оказались взаимозависимыми.

Проще говоря, бактериальная система не просто последовательно соединяет готовые детали. Она координирует химические реакции, чтобы правильно собрать сложную структуру.

Это открытие расширяет представления о том, как работают природные молекулярные механизмы синтеза, и дает исследователям дополнительные ориентиры для поиска веществ, которые пока остаются скрытыми в геномах микроорганизмов.

Как найти действие вещества, которое не убивает клетки

Обычно при поиске потенциальных противоопухолевых препаратов исследователи начинают с оценки влияния соединения на клетки: подавляет ли оно их рост, нарушает ли жизненно важные процессы или вызывает гибель.

Миксоглюкамиды оказались интересным исключением.

У новых природных соединений не было выявлено выраженного эффекта, который позволил бы сразу рассматривать их как противоопухолевые вещества. Тем не менее необычная структура заставила ученых продолжить изучение.

Для этого возникла практическая проблема: бактерии производили слишком мало вещества для масштабных биохимических исследований.

Во второй работе команда Томаса Симона и Марка Брёнструпа разработала метод полного химического синтеза миксоглюкамида A.

Исследователи смогли собрать природную молекулу из более простых компонентов. Самая длинная последовательность синтеза включала 11 стадий, а общий выход конечного продукта составлял 2,4%.

Хотя такой выход пока далек от требований промышленного производства, лабораторная методика позволила получать вещество независимо от бактерий и создавать его модифицированные варианты.

Затем ученые применили метод ABPP — профилирование белков с помощью химически активных зондов.

Его принцип напоминает молекулярную рыбалку.

К исследуемому соединению присоединяют специальную химическую метку. Затем используют этот зонд для выявления белков, с которыми взаимодействует молекула. После выделения связанных белков их идентифицируют с помощью масс-спектрометрии.

В данном случае эксперименты проводили с клеточными экстрактами человеческой линии A549, происходящей из опухоли легкого.

Анализ выявил несколько взаимодействующих белков, но главным функционально подтвержденным объектом исследования стал фермент AKR1C3.

Почему фермент AKR1C3 интересует исследователей рака

AKR1C3 — это альдо-кеторедуктаза, фермент, участвующий в химических превращениях различных веществ внутри организма.

В частности, он играет роль в обмене стероидных гормонов, включая образование тестостерона и эстрадиола, а также участвует в метаболизме простагландинов — молекул, регулирующих воспалительные и другие физиологические процессы.

В норме эти реакции необходимы организму. Проблемы могут возникать, когда активность фермента изменяется и начинает поддерживать патологические процессы.

Повышенная экспрессия AKR1C3 обнаружена при некоторых опухолях предстательной железы, молочной железы и легкого, а также при отдельных формах лейкоза.

В определенных биологических условиях фермент способен поддерживать рост и размножение опухолевых клеток, а также процессы, связанные с их распространением.

Поэтому AKR1C3 рассматривают как одну из потенциальных мишеней для разработки лекарств.

Важно понимать разницу: обнаружение повышенного уровня фермента при опухоли не означает, что он является причиной любого рака или что его блокирование обязательно остановит заболевание.

Опухолевая клетка использует множество взаимосвязанных механизмов выживания. Значение конкретного фермента зависит от типа опухоли, ее молекулярных особенностей и состояния других сигнальных путей.

Тем не менее возможность избирательно подавлять AKR1C3 представляет интерес для разработки новых терапевтических подходов.

Насколько сильно миксоглюкамиды подавляют AKR1C3

Ученые проверили действие миксоглюкамида A непосредственно на фермент.

В лабораторных условиях соединение подавляло его активность с показателем IC50, равным 1,61 мкМ.

IC50 — это концентрация вещества, необходимая для уменьшения измеряемой активности фермента наполовину. Чем ниже показатель при одинаковых условиях эксперимента, тем меньше вещества требуется для достижения такого эффекта.

Исследователи синтезировали и изучили 20 структурных аналогов миксоглюкамида.

Некоторые химические изменения существенно усилили действие. Наиболее активный из представленных вариантов имел IC50 около 0,181 мкМ, то есть приблизительно в девять раз ниже, чем у исходного природного соединения.

Дополнительные эксперименты показали, что миксоглюкамид A действует как конкурентный ингибитор: он препятствует работе фермента, занимая область связывания его субстрата.

Ученые также получили трехмерную структуру комплекса миксоглюкамида A с AKR1C3 методом рентгеновской кристаллографии.

Это позволило увидеть, какие части молекулы участвуют во взаимодействии с ферментом и какие химические изменения потенциально могут усилить связывание.

Но самый интересный результат касался не только мощности ингибирования.

Неожиданный результат: сахар оказался необязательным для подавления фермента

Первоначально необычное сочетание сахара, липида и аминокислот выглядело ключевой особенностью нового класса веществ.

Однако при изучении отдельных структурных элементов выяснилось, что сахарный фрагмент не обязателен для ингибирования AKR1C3.

Вариант соединения без сахара подавлял фермент даже эффективнее исходного миксоглюкамида A.

При этом изменение жирнокислотной цепи заметно влияло на активность. Особенно эффективными оказались некоторые аналоги с ненасыщенными жирнокислотными фрагментами.

Рентгеноструктурный анализ помог объяснить эти наблюдения.

Пептидная часть молекулы взаимодействовала с активным центром фермента, тогда как липидная цепь занимала гидрофобную область, то есть участок, предпочитающий контактировать с неполярными химическими группами.

Сахар располагался преимущественно за пределами основного участка связывания.

Ученые предполагают, что в природной молекуле он может выполнять другие задачи, например влиять на растворимость, стабильность или транспорт вещества. Однако эти функции пока не установлены.

Еще одно предположение исследователей не подтвердилось: несмотря на присутствие химически реакционноспособной группы, миксоглюкамид не образовывал ожидаемой ковалентной связи с AKR1C3.

Таким образом, химическая структура, кажущаяся наиболее необычной, не обязательно действует так, как можно предположить по ее составу. Реальный механизм удалось установить только экспериментально.

Почему подавление фермента пока не означает победу над опухолью

Здесь находится главное ограничение исследования.

Несмотря на подтвержденное действие миксоглюкамидов на AKR1C3, ученые не смогли продемонстрировать выраженный противоопухолевый эффект исходного соединения.

Миксоглюкамид A не проявлял цитотоксичности в исследованной клеточной линии A549 даже при концентрации 100 мкМ.

Некоторые синтетические аналоги действительно снижали жизнеспособность клеток при более высоких концентрациях. Однако выраженность этого эффекта не соответствовала степени ингибирования AKR1C3.

Авторы предполагают, что цитотоксичность отдельных производных могла быть связана с другими, неспецифическими механизмами, включая изменения липофильности молекул.

Это принципиальное различие.

Вещество может эффективно блокировать определенный фермент в пробирке, но не оказывать нужного действия на опухолевые клетки. Например, оно может недостаточно проникать внутрь клеток, изменяться в биологической среде или воздействовать на мишень, блокирование которой в конкретной клеточной модели не приводит к гибели клетки.

Исследования миксоглюкамидов пока не установили, способны ли эти вещества подавлять развитие опухолей у животных или приносить пользу пациентам.

Также предстоит изучить их фармакокинетику, возможную токсичность, избирательность действия в живых клетках и применимость к различным типам опухолей.

Поэтому миксоглюкамиды пока следует рассматривать не как противоопухолевые препараты, а как исходные химические структуры для дальнейшей разработки потенциальных ингибиторов AKR1C3.

Почему это открытие может изменить поиск будущих лекарств

Обычно перспективность нового вещества оценивают по заметному биологическому результату: гибели опухолевых клеток, подавлению бактерий или выраженному изменению клеточной функции.

Но такой подход имеет ограничение.

Если вещество взаимодействует с важным белком, однако не вызывает немедленного и легко измеримого эффекта, его можно ошибочно считать неинтересным.

История миксоглюкамидов показывает альтернативный путь.

Сначала исследователи обнаружили необычные гены. Затем активировали скрытый биосинтетический механизм и получили новый класс молекул. После этого научились создавать их химически, определили белковую мишень и установили, какие структурные изменения усиливают взаимодействие с ней.

При этом отсутствие сильного эффекта на жизнеспособность клеток не стало причиной прекращения исследования.

Для фармацевтической разработки такой результат имеет самостоятельную ценность. Найденная молекула не обязана сама становиться лекарством. Она может служить отправной точкой для создания соединений с более подходящими свойствами.

Следующим этапом станет проверка того, можно ли превратить миксоглюкамиды в вещества, которые не только эффективно подавляют AKR1C3 в биохимическом эксперименте, но и избирательно воздействуют на этот фермент в живых клетках, вызывая необходимый терапевтический эффект.

Для пациентов сегодняшнее открытие пока ничего не меняет в лечении. Но оно расширяет набор химических инструментов, с помощью которых исследователи могут искать новые подходы к терапии.