Анализ крови за $60 научили распознавать химический след рака лёгкого

Вместо чтения последовательности ДНК исследователи заставили её светиться — и получили точность выше 90% при раке лёгкого II–IV стадий

Рак оставляет в крови следы своей ДНК. Проблема в том, что найти эти фрагменты среди огромного количества обычной ДНК сложно — особенно если не использовать дорогостоящее секвенирование.

Команда под руководством профессора Юваля Эбенштейна из Тель-Авивского университета предложила другой способ. Вместо того чтобы читать последовательность ДНК буква за буквой, исследователи выявляют её химический рисунок и превращают его в световой сигнал.

Именно это делает работу особенно интересной: потенциальный диагностический маркер становится видимым без секвенирования генома.

Опухоль меняет не только ДНК, но и её химические метки

Чтобы понять идею теста, нужно различать генетические и эпигенетические изменения.

Мутация меняет саму последовательность ДНК. Метилирование работает иначе: к определённым участкам ДНК присоединяются небольшие химические метки — метильные группы. Они не переписывают генетический код, но связаны с тем, насколько активно работают разные участки генома.

У клеток разных тканей существуют характерные рисунки метилирования. При злокачественном превращении этот рисунок меняется.

Когда клетки погибают и разрушаются, фрагменты их ДНК попадают в кровь. Такая циркулирующая вне клеток ДНК называется cell-free DNA, или cfDNA.

Часть этих фрагментов может происходить из опухоли. Значит, теоретически рак можно искать не только по мутациям, но и по необычному рисунку химических меток на ДНК.

Именно на этом построен новый метод.

Как анализ крови на рак лёгкого превращает метилирование в свет

Сначала из плазмы крови исследователи выделяют cfDNA. Затем ДНК проходит бисульфитную обработку — химическую процедуру, позволяющую различить исходно метилированные и неметилированные участки.

После этого ДНК амплифицируют с помощью ПЦР.

Дальше начинается наиболее необычная часть метода. Исследователи используют модифицированный бактериальный фермент — метилтрансферазу M.MpeI. Он позволяет присоединить химическую «ручку» к нужным CpG-участкам, после чего к ней прикрепляется флуорофор — молекула, способная испускать свет.

В результате участки, соответствующие метилированным позициям исходной cfDNA, получают флуоресцентную метку.

Затем образец помещают на стандартный гибридизационный микрочип. На нём находятся зонды, соответствующие определённым областям генома. Чем сильнее флуоресценция конкретной точки микрочипа, тем больше соответствующий участок был метилирован в исходном образце.

Проще говоря, исследователи не читают ДНК. Они заставляют её химические метки светиться и анализируют получившийся рисунок.

Рак оказался похож не на одну метку, а на световой узор

Это ключевой момент исследования.

Для диагностики недостаточно найти один «ген рака лёгкого». Авторы искали комбинацию областей генома, в которых рисунок метилирования систематически различался у пациентов с опухолью и у здоровых людей.

Всего в исследование вошли 103 человека: 51 пациент с раком лёгкого II–IV стадий и 52 сопоставимых по возрасту здоровых участника.

Сначала использовали обучающую группу из 22 пациентов и 21 здорового участника. Анализ позволил выделить 170 областей генома с наиболее выраженными различиями метилирования.

Затем эту сигнатуру проверили вслепую на независимой группе: 29 пациентах с раком и 31 здоровом участнике.

Получился своеобразный молекулярный штрихкод заболевания.

Более 90% — сильный результат, но здесь легко ошибиться в его интерпретации

В слепой валидационной группе чувствительность теста достигла 93,1% при специфичности 90,3%. Площадь под ROC-кривой, AUC, составила 0,947.

Чувствительность показывает, какую долю людей с заболеванием тест способен правильно распознать. Специфичность — какую долю людей без заболевания он правильно определяет как не имеющих рака.

На первый взгляд цифры выглядят почти как параметры готового диагностического теста. Но сами авторы подчёркивают важное ограничение.

Сравнение проводилось со здоровыми людьми.

В реальной клинике гораздо сложнее отличить рак не от полностью здорового лёгкого, а, например, от доброкачественного узла, воспаления или другого заболевания. Поэтому авторы прямо предупреждают: полученная специфичность, вероятно, завышает будущую специфичность теста в реальной клинической популяции.

Это принципиальное различие между многообещающим экспериментом и доказанным методом скрининга.

Главная цель — не заменить КТ

Низкодозная компьютерная томография уже доказала способность снижать смертность от рака лёгкого у людей с повышенным риском. Но у КТ есть другая проблема: на снимках часто обнаруживаются небольшие лёгочные узлы, и большинство из них не являются раком.

В крупных исследованиях скрининга доля положительных результатов, впоследствии не подтверждавшихся как рак, была значительной. Это может означать дополнительные обследования, повторные КТ, тревогу и иногда инвазивные процедуры.

Поэтому авторы рассматривают анализ крови прежде всего как дополнение к визуализации.

Представьте ситуацию: КТ обнаруживает небольшой узел. Изображение показывает его форму, размеры и расположение, а кровь потенциально добавляет другую информацию — присутствует ли молекулярный рисунок, характерный для опухоли.

Один метод показывает структуру. Другой — биологический след.

Их сочетание теоретически может оказаться информативнее каждого метода по отдельности, но именно такую клиническую пользу новому тесту ещё предстоит подтвердить.

Почему отсутствие секвенирования здесь действительно имеет значение

Многие современные жидкостные биопсии используют секвенирование нового поколения. Это мощная технология, но она требует подготовки образцов, оборудования, достаточной глубины чтения ДНК и вычислительного анализа.

Авторы нового подхода пытаются получить диагностическую информацию другим способом.

После химической и ферментативной обработки образец считывается на микрочипе по интенсивности флуоресценции. Исследователи сообщают, что в нынешнем варианте анализ выполняется за 2–3 дня и обходится примерно в $60 на образец при использовании коммерческих 24-образцовых микрочипов.

Это не означает, что будущий клинический тест обязательно будет стоить $60 для пациента. Указанная сумма относится к текущей исследовательской процедуре и не включает всю экономику будущего диагностического продукта, лаборатории и здравоохранения.

Но сама технологическая идея важна: если диагностически полезный эпигенетический сигнал действительно можно получать без секвенирования, барьер для масштабирования таких анализов потенциально становится ниже.

Световой рисунок подсказал даже тип опухоли

Исследователи обнаружили ещё одну особенность.

В группе немелкоклеточного рака лёгкого они сравнили два распространённых гистологических варианта — аденокарциному и плоскоклеточный рак. Для этого анализа была получена отдельная панель из 168 метилированных областей.

Она различала два подтипа с AUC 0,881. Правильно классифицировались 86,4% образцов плоскоклеточного рака и 88,2% образцов аденокарциномы.

Это пока не основание использовать метод для определения типа опухоли в клинике. Но результат показывает важную особенность метилирования: химический рисунок ДНК способен содержать больше информации, чем простой ответ «рак есть или нет».

Самый неожиданный результат появился после начала лечения

Авторы попробовали посмотреть, меняется ли молекулярный рисунок вместе с опухолью.

Для этого они проследили всего за двумя пациентами с распространённым немелкоклеточным раком лёгкого, получавшими химиоиммунотерапию.

У пациента, который не ответил на лечение и у которого опухолевая нагрузка немного увеличилась, существенного сдвига метилирования не произошло.

У второго пациента лечение дало выраженный ответ по данным ПЭТ-КТ. Одновременно его метилированный профиль сдвинулся в сторону кластера здоровых образцов.

Вот здесь возникает особенно интересная перспектива: кровь потенциально может показывать не только наличие молекулярного следа опухоли, но и его изменение во времени.

Однако два пациента — это наблюдение, а не клиническое доказательство. Авторы прямо указывают, что возможность мониторинга ответа на терапию требует проверки в гораздо большей группе.

Самого важного испытания тест пока не прошёл

Заголовок «анализ крови обнаруживает рак лёгкого с точностью более 90%» легко понять неправильно.

Исследование не показало, что тест способен надёжно находить ранний рак лёгкого у бессимптомных людей.

В работу включались пациенты с раком II–IV стадий. Именно для этой группы получены основные показатели чувствительности и специфичности.

А для скрининга особенно важна I стадия — когда опухоль ещё невелика, количество опухолевой ДНК в крови может быть гораздо меньше, а лечение потенциально наиболее эффективно.

Кроме того, выборка была небольшой — всего 103 участника. Контроль составляли здоровые люди, а не большая группа пациентов с доброкачественными узлами и другими заболеваниями лёгких.

Поэтому следующий вопрос намного сложнее первоначального: сможет ли анализ работать так же хорошо среди тысяч людей, пришедших на реальный скрининг?

Пока ответа нет.

Что должно произойти, прежде чем такой тест появится в практике

Авторы уже работают над более специализированным микрочипом для рака лёгкого. В статье также сообщается о подготовке более крупного проспективного исследования LUMEN для оценки способности метода предсказывать ответ опухоли на системное лечение.

Будущим исследованиям предстоит проверить несколько вещей одновременно: ранние стадии заболевания, разнообразные популяции пациентов, доброкачественные заболевания лёгких, воспроизводимость между лабораториями и реальную пользу комбинации анализа крови с КТ.

Есть и коммерческий контекст, который важно учитывать при оценке результатов. Интеллектуальная собственность на технологию лицензирована компании JaxBio Technologies. Руководитель исследования Юваль Эбенштейн является её основателем и владеет долей в компании, несколько соавторов работают в ней, а один из авторов выступает научным консультантом. На технологию также подана патентная заявка.

Наличие таких интересов не делает результаты неверными. Но это ещё одна причина, почему независимая и масштабная клиническая валидация будет особенно важна.