Как слабые молекулярные связи помогают системе не зависеть от температуры

Российские учёные экспериментально подтвердили, что устойчивость молекулярной сети может обеспечиваться не прочностью связей, а их взаимной компенсацией

Работа Егора Коренкова и Максима Никитина, опубликованная в Nature Communications, предлагает новый подход к созданию устойчивых биосенсоров и молекулярных систем управления. Её главный вывод неожиданен: иногда надёжность обеспечивают не прочные, а слабые взаимодействия, способные компенсировать изменения друг друга.

Почему изменение температуры становится проблемой для живой клетки

Бактерия попадает из холодной почвы в тёплый организм. Температура резко меняется, химические реакции перестраиваются, но клетке по-прежнему необходимо распознавать сигналы, регулировать обмен веществ и управлять работой генов.

Человек поддерживает относительно постоянную внутреннюю температуру. Однако многие организмы — от бактерий до рыб и рептилий — такой возможности не имеют. Температура их тела может значительно меняться вместе с окружающей средой.

При этом молекулярные сигнальные системы должны продолжать работать.

Возникает фундаментальный вопрос: как сохраняется согласованность множества химических взаимодействий, если характеристики отдельных реакций меняются при нагревании или охлаждении?

Именно эту проблему исследовали учёные МФТИ и Университета «Сириус».

Молекулярная коммутация: когда слабые связи передают информацию

В основе исследования лежит принцип молекулярной коммутации, впервые представленный Максимом Никитиным в работе, опубликованной в Nature Chemistry в 2023 году.

Его суть заключается в том, что молекулы способны обрабатывать информацию благодаря множеству слабых, обратимых взаимодействий.

Обычно ДНК воспринимают как носитель наследственной информации. Но короткие цепочки ДНК могут выполнять и другую функцию — связываться с различными молекулярными партнёрами, конкурировать между собой и изменять доступность определённых компонентов системы.

Так возникают своеобразные молекулярные логические элементы.

В электронном компьютере логический элемент преобразует входной сигнал в выходной. В молекулярной системе аналогичную задачу может выполнять набор взаимодействующих цепочек ДНК.

Одна цепочка связывает сигнальную молекулу. Другая конкурирует за её партнёра и освобождает сигнал. Изменяя концентрации и силу взаимодействий, можно получать разные ответы на входные воздействия.

Особенность такого подхода заключается в том, что результат возникает благодаря перераспределению молекул внутри сети, без обязательного центрального управляющего элемента.

Но здесь появляется проблема: прочность молекулярных связей зависит от температуры.

Исследователи решили выяснить, можно ли использовать эту зависимость не как препятствие, а как средство стабилизации.

Почему самая прочная связь не всегда самая надёжная

Интуитивно кажется, что надёжная молекулярная система должна состоять из максимально прочно связанных компонентов.

Если молекулы крепко соединяются, изменение температуры с меньшей вероятностью приведёт к распаду комплекса. Однако у такой стратегии есть недостаток.

Слишком прочные взаимодействия могут существенно замедлять перестройку системы.

Это подтвердили лабораторные измерения. ДНК-комплексы с константой диссоциации около 1 наномоля приближались к равновесию примерно за час. При гораздо более прочном связывании — с константами порядка 100 фемтомолей или ниже — за четыре часа сигнал не достигал даже половины равновесного значения.

Константа диссоциации характеризует склонность молекулярного комплекса распадаться на свободные компоненты. Чем она меньше, тем прочнее связывание при прочих равных условиях.

Получается, что для молекулярной сети важна не только способность удерживать связи, но и возможность достаточно быстро их менять.

И здесь появляется неожиданный принцип: система из слабых, чувствительных к температуре взаимодействий может быть устойчивее системы, построенной на максимально прочных связях.

Однако дело не в слабости самой по себе. Решающее значение имеет организация взаимодействий.

Как работает молекулярная компенсация

Для объяснения механизма исследователи использовали простой молекулярный логический элемент YES — систему, которая должна выдавать высокий сигнал при наличии входного воздействия и низкий при его отсутствии.

В исходной конструкции участвуют три короткие цепочки ДНК.

Одна служит входным сигналом. Вторая связывает сигнальную цепочку и удерживает её в связанном состоянии. Когда появляется входная молекула, она конкурирует за связывающего партнёра и освобождает сигнальную цепочку.

В эксперименте количество свободной сигнальной ДНК определяли с помощью флуоресцентных меток.

Проблема возникала при изменении температуры: прочность взаимодействий менялась, а вместе с ней менялась концентрация свободной сигнальной молекулы.

Авторы предложили добавить ещё одного участника — компенсатор.

Его взаимодействие специально подобрали так, чтобы при низкой температуре он достаточно сильно связывался с одной из молекул сети, а при нагревании эта связь заметно ослабевала.

В результате температурное изменение одного взаимодействия уравновешивалось изменением другого.

При охлаждении компенсатор активнее связывает молекулярного партнёра. При нагревании освобождает его. Благодаря правильно подобранным концентрациям и характеристикам связей выходной сигнал остаётся близким к заданному значению.

Такой механизм исследователи назвали топологической компенсацией: устойчивость определяется устройством сети взаимодействий между компонентами.

Это центральный принцип исследования.

Не обязательно делать каждую молекулярную связь нечувствительной к температуре. Можно организовать сеть так, чтобы изменения отдельных связей взаимно компенсировались.

Главный эксперимент: 25-кратное изменение против колебаний менее 20%

Исследователи проверили предложенный механизм в лаборатории, сравнив две конструкции молекулярного логического элемента YES.

Первая представляла собой обычную ДНК-систему без компенсации. Во второй присутствовала дополнительная цепочка ДНК, предназначенная для стабилизации сигнала.

Обе конструкции исследовали при температурах от 25 до 50 °C.

Результаты оказались существенно различными.

В контрольной системе без компенсатора концентрация свободной сигнальной ДНК при отсутствии входного сигнала изменялась примерно в 25 раз.

В компенсированной системе изменение концентрации свободной сигнальной ДНК оставалось менее 20% во всём исследованном температурном диапазоне. Причём стабильность сохранялась как при отсутствии, так и при наличии входного сигнала.

Состояние системы оценивали по флуоресценции. Основные измерения проводили с тремя экспериментальными повторениями.

Таким образом, учёные не просто предложили математическую концепцию. Они изготовили молекулярную конструкцию, измерили её поведение и показали, что добавление компенсирующего взаимодействия действительно позволяет существенно уменьшить температурную зависимость выходного сигнала.

Именно это — главный экспериментально подтверждённый результат работы.

От 0,1 до 50 °C: что дополнительно показало моделирование

Лабораторный эксперимент охватывал диапазон 25-50 °C. Однако исследователи также изучили возможности компенсации при значительно более широких температурных изменениях.

С помощью компьютерного моделирования они разработали ДНК-систему, способную сохранять заданные выходные сигналы при температурах от 0,1 до 50 °C.

Для этого потребовался каскад нескольких компенсирующих взаимодействий.

Каждое из них ослабевало при нагревании по-своему. Последовательное перераспределение молекул позволяло корректировать состояние системы не только при крайних температурах, но и между ними.

При этом константы диссоциации отдельных взаимодействий изменялись более чем на девять порядков — свыше миллиарда раз.

Иными словами, отдельные молекулярные связи становились значительно слабее или сильнее, но выходной сигнал сохранял заданное значение.

Здесь важно разграничить результаты: устойчивость в диапазоне 0,1-50 °C и миллиардные изменения констант диссоциации были продемонстрированы в компьютерной модели, а не в лабораторном эксперименте.

Система справилась и с изменением концентрации солей

Температура — не единственный фактор, влияющий на молекулярные взаимодействия.

Для ДНК и РНК большое значение имеет ионный состав раствора. Положительно заряженные ионы, включая натрий и магний, влияют на связывание отрицательно заряженных цепочек нуклеиновых кислот.

Изменение концентрации солей способно существенно нарушить работу молекулярной сигнальной системы даже при постоянной температуре.

Исследователи проверили, можно ли использовать тот же принцип компенсации для защиты от таких изменений.

Они создали специальные ДНК-логические элементы и экспериментально исследовали их при изменении концентрации натрия от 0,1 до 1 моль/л, а магния — от 1 до 10 ммоль/л.

В обоих случаях концентрация соответствующего иона изменялась десятикратно.

Системы с компенсирующими взаимодействиями сохраняли значительно более стабильный выходной сигнал, чем контрольные конструкции.

Это расширяет потенциальные возможности подхода: молекулярные устройства могут быть устойчивы не только к температурным колебаниям, но и к изменениям химического состава среды.

Когда температура превращается из помехи в управляющий сигнал

Ещё более интересный результат исследователи получили, когда отказались от задачи сохранять сигнал постоянным.

Оказалось, что молекулярной сети можно заранее задать желаемую зависимость выходного сигнала от температуры.

Например, сигнал может увеличиваться при нагревании, сначала уменьшаться, а затем возрастать или изменяться по кривой, напоминающей синусоиду.

Для этого учёные использовали математическую оптимизацию, подбирая последовательности ДНК и концентрации молекул таким образом, чтобы совокупность взаимодействий воспроизводила нужную функцию.

На компьютерных моделях удалось получить линейные, квадратичные, кубические и синусоидальные зависимости.

Таким образом, температура может выступать не только фактором, от которого необходимо защищаться, но и управляющим сигналом.

Теоретически это позволяет создавать молекулярные системы, которые реагируют на изменение температуры по заранее заданному алгоритму.

Например, один молекулярный контур мог бы увеличивать выходной сигнал при нагревании, другой — уменьшать, а третий — реагировать только в определённом температурном диапазоне.

Это открывает перспективы для создания программируемых биосенсоров и систем управления биохимическими процессами.

Однако сложные программируемые температурные зависимости пока продемонстрированы вычислительно. Их реализация в работающих экспериментальных устройствах остаётся следующей задачей.

Может ли такой механизм существовать в живых клетках

Результаты исследования предлагают возможное объяснение того, как биологические сигнальные сети способны выдерживать изменения внешних условий.

В живой клетке одновременно взаимодействует огромное количество белков, РНК, небольших регуляторных молекул и других веществ. Многие из этих связей обратимы, а их характеристики зависят от температуры.

Авторы предполагают, что механизмы топологической компенсации могли появиться ещё на ранних этапах эволюции и помогать примитивным биологическим системам существовать в нестабильных условиях.

В более сложных организмах температурная чувствительность молекулярных сетей теоретически могла приобрести дополнительную функцию — обеспечивать различные клеточные ответы на изменение температуры.

Например, во время лихорадки разные типы клеток способны реагировать на повышение температуры неодинаково. Авторы рассматривают возможность участия подобных сетевых механизмов в такой регуляции.

Для оценки возможностей подхода они также смоделировали сеть из 100 рецепторов и 100 активирующих молекул. После оптимизации компенсирующих взаимодействий расчётные уровни активации оставались близкими к заданным значениям при двух температурах.

Но здесь существует принципиальное ограничение.

Исследование пока не доказывает, что живые клетки действительно используют обнаруженный механизм температурной самостабилизации.

Чтобы подтвердить такую возможность, необходимо обнаружить соответствующие взаимодействия в естественных биологических сетях и экспериментально установить их компенсаторную роль.

Смогут ли биотехнологические производства отказаться от климат-контроля

Одна из перспектив исследования связана с биотехнологическим производством.

Антитела, гормоны, компоненты вакцин и многие другие биологические препараты получают с помощью процессов, чувствительных к температуре, составу среды и состоянию клеток.

Поддержание необходимых условий требует оборудования, энергии и постоянного контроля.

Если отдельные молекулярные регуляторные системы удастся сделать внутренне устойчивыми к изменениям среды, это потенциально позволит упростить некоторые технологические операции.

В первую очередь предложенный принцип может оказаться полезным для разработки биосенсоров, молекулярных вычислительных устройств и синтетических систем управления биохимическими реакциями.

Однако говорить о производстве антител или вакцин без температурного контроля пока преждевременно.

В исследовании не проверяли полноценные промышленные биореакторы, живые клеточные культуры для производства лекарств или качество получаемых белковых препаратов.

Кроме того, стабильность сигнальной сети не означает автоматической стабильности всех остальных процессов. Белки могут терять правильную пространственную структуру, клетки имеют собственные температурные ограничения, а производство лекарств требует соблюдения дополнительных условий качества и безопасности.

Поэтому обнаруженный механизм не отменяет требований к производству и хранению биологических препаратов, включая соблюдение холодовой цепи.

Какие вопросы ещё предстоит решить

Несмотря на убедительную лабораторную демонстрацию, исследование имеет несколько важных ограничений.

Прежде всего, большая часть компьютерных расчётов относится к системам, достигшим химического равновесия. Реальные клетки постоянно расходуют энергию и работают в условиях непрерывного изменения концентраций веществ и скоростей реакций.

Поэтому необходимо проверить, насколько хорошо компенсация действует в динамических системах, далёких от равновесия.

Другая проблема связана с точностью компьютерных прогнозов.

Использованная программа NUPACK позволяет рассчитывать взаимодействия нуклеиновых кислот, но её предсказания не всегда точно совпадали с экспериментальными измерениями, особенно для некоторых слабосвязывающихся ДНК-пар.

Исследователям пришлось дополнительно измерять характеристики взаимодействий и корректировать параметры конструкций.

Следующими этапами могут стать изучение компенсации в белковых и смешанных молекулярных сетях, экспериментальная реализация программируемых температурных зависимостей и поиск аналогичных механизмов в живых клетках.

Лишь после этого можно будет оценить, насколько широко предложенный принцип применим в биологии и промышленной биотехнологии.