Учёные восстановили иммунное оружие возрастом 160 миллионов лет

Древние версии пептида показали, как несколько мутаций превратили часть обычного белка в средство прямой атаки на бактерии

Обычно поиск новых антибиотиков направлен вперёд: учёные создают новые молекулы, перебирают химические библиотеки и пытаются найти неизвестные способы атаковать бактерии.

Команда из Орегонского университета пошла в противоположную сторону — примерно на 160 миллионов лет назад. Исследователи вычислили последовательности белков, которые, вероятно, существовали у давно исчезнувших предков плацентарных млекопитающих, а затем воспроизвели их в лаборатории.

И оказалось, что эволюционное прошлое сохранило весьма интересные варианты антибактериального оружия.

Учёные не нашли древний белок — они вычислили его

Фраза «восстановили белок возрастом 160 миллионов лет» звучит так, будто исследователи извлекли молекулу из окаменелости. На самом деле технология гораздо интереснее.

Белки не сохраняются в пригодном для такого эксперимента состоянии десятки и тем более сотни миллионов лет. Поэтому команда использовала метод ancestral sequence reconstruction — реконструкцию последовательностей предковых белков.

Принцип можно представить как восстановление текста давно исчезнувшей рукописи по множеству её более поздних копий.

Исследователи сравнивают последовательности одного и того же белка у современных видов, знают их эволюционное родство и с помощью статистических методов рассчитывают, какие аминокислоты с наибольшей вероятностью находились в определённых позициях белка у общего предка.

Получается не найденная древняя молекула, а научно обоснованная реконструкция её наиболее вероятной последовательности.

После этого начинается экспериментальная часть: рассчитанную последовательность можно синтезировать и проверить, что такая молекула действительно умеет делать.

Именно так исследователи фактически получили возможность экспериментировать с несколькими этапами эволюции одного иммунного механизма.

Всё началось с белка, который отбирает у бактерий железо

В центре исследования оказался лактоферрин.

Это железосвязывающий белок, который присутствует, например, в грудном молоке, слезах, слюне и слизистых секретах. Он относится к семейству трансферринов и возник после дупликации — то есть копирования — гена трансферрина у предка плацентарных млекопитающих примерно 160 миллионов лет назад.

Одна из защитных функций лактоферрина связана с железом.

Железо необходимо не только человеку. Оно требуется и многим микроорганизмам. Поэтому организм использует довольно необычный способ защиты: старается сделать свободное железо недоступным для патогенов.

Такой механизм называют nutritional immunity — «пищевым», или нутритивным, иммунитетом. Лактоферрин очень прочно связывает железо и тем самым ограничивает доступ бактерий к этому ресурсу.

Но в процессе эволюции у него появилась ещё одна линия защиты.

В определённой части молекулы находится короткий участок, из которого может образовываться антимикробный пептид — лактоферрицин.

И он действует уже гораздо более непосредственно.

Как короткий пептид превращается в оружие против бактерий

Бактериальная клетка окружена мембраной, целостность которой жизненно необходима для её существования.

Лактоферрицин содержит много положительно заряженных и гидрофобных аминокислот. Такое сочетание позволяет пептиду взаимодействовать с бактериальной поверхностью и нарушать структуру мембраны.

Проще говоря, одна часть свойств помогает молекуле приблизиться к бактериальной оболочке, а другая — встроиться в неё.

Если повреждение достаточно серьёзное, мембрана становится проницаемой, клетка теряет способность поддерживать необходимую внутреннюю среду и может погибнуть.

Исследователей заинтересовал фундаментальный вопрос: как вообще возникла эта способность?

Современный белок показывает только конечный результат миллионов лет эволюции. Поэтому команда попыталась восстановить промежуточные версии.

160 миллионов лет эволюции поместили в один эксперимент

Учёные реконструировали предковые варианты лактоферрина и соответствующие участки лактоферрицина, представляющие разные этапы эволюционной истории.

Затем синтезированные пептиды проверили против нескольких бактерий, связанных с заболеваниями человека.

Среди них были:

• Pseudomonas aeruginosa: синегнойная палочка, способная вызывать тяжёлые, в том числе внутрибольничные инфекции;
• Staphylococcus aureus: золотистый стафилококк;
• Escherichia coli;
• Streptococcus agalactiae: стрептококк группы B, особенно значимый при инфекциях новорождённых.

Исследователи наблюдали не только за ростом бактериальных культур, но и за выживанием бактерий и повреждением их мембран.

Так появилась возможность увидеть то, чего невозможно наблюдать непосредственно: постепенное формирование новой иммунной функции на протяжении огромного промежутка эволюционного времени.

Самый древний вариант уже пробивал мембрану — но этого оказалось недостаточно

Именно здесь исследование даёт особенно интересный результат.

Самые ранние реконструированные варианты лактоферрицина уже приобрели способность нарушать бактериальные мембраны.

На первый взгляд можно было бы решить, что механизм уничтожения бактерий уже сформировался.

Но бактерии не обязательно погибали.

Они, по-видимому, могли пережить полученное повреждение и восстановиться. Иными словами, способность проделать брешь в мембране ещё не равнозначна способности эффективно уничтожить клетку.

Это важное различие.

Эволюция нового защитного механизма, судя по результатам работы, выглядела не как внезапное появление полностью готового «антибиотика». Сначала возникла частичная функция — способность повреждать мембрану. Затем последующие изменения усиливали эффект, пока некоторые варианты не приобрели выраженную бактерицидную активность.

Несколько аминокислот смогли резко изменить результат

По мере эволюции участок лактоферрицина становился богаче положительно заряженными и гидрофобными аминокислотами. Вместе с этим менялись его антимикробные свойства.

Но особенно показательно то, насколько небольшими могли быть необходимые изменения.

Авторы обнаружили, что отдельные аминокислотные замены способны существенно менять эффективность пептида. В экспериментах с человеческим лактоферрицином замена одной аминокислоты в эволюционно изменчивой позиции заметно усиливала активность против некоторых стафилококков.

Это и есть главный «момент осознания» исследования.

Для появления значительно более эффективной антибактериальной молекулы не всегда требуется полностью новый белок. Иногда эволюция меняет несколько элементов уже существующей структуры — и свойства молекулы становятся другими.

Причём современная человеческая версия вовсе не обязана быть максимально сильной из всех возможных.

Эволюция оптимизирует организм не под лабораторный показатель «убивать как можно больше бактерий». На свойства белка одновременно могут влиять разные функции, физиологические ограничения и взаимодействия с другими компонентами организма.

Поэтому некоторые реконструированные или экспериментально изменённые варианты действительно могут демонстрировать более высокую антимикробную активность, чем человеческий пептид.

Древний пептид пока нельзя назвать новым антибиотиком

Здесь особенно важно не сделать из исследования вывод, которого авторы не делали.

Работа опубликована в PLOS Biology и представляет собой фундаментальное исследование эволюции иммунного белка. Это не испытание нового препарата.

Эксперименты проводились in vitro — в лабораторных условиях, на современных бактериальных штаммах. Исследователи не могут восстановить микроорганизмы, с которыми сталкивались млекопитающие десятки или сотни миллионов лет назад.

Кроме того, активность антимикробных пептидов сильно зависит от окружающей среды. То, что хорошо работает в лабораторной системе, совсем не обязательно будет столь же эффективно внутри человеческого организма.

Есть и чисто фармакологическая проблема.

Пептиды обычно менее стабильны, чем многие традиционные антибиотики, и могут быстро разрушаться в организме. Чтобы превратить перспективную последовательность в лекарство, необходимо решить вопросы стабильности, доставки, дозирования, токсичности и избирательности действия.

Поэтому между результатами этого исследования и новым препаратом против устойчивой инфекции лежит большой путь.

Почему тогда фармакологам вообще интересны молекулы из юрского периода

Ценность исследования не столько в конкретном «древнем антибиотике», сколько в способе поиска новых молекул.

Обычно разработчик может создавать тысячи вариантов пептида и проверять их один за другим. Эволюционная реконструкция предлагает дополнительный источник информации.

За миллионы лет природа уже создала множество вариантов одной и той же молекулярной конструкции. Часть исчезла вместе с предковыми видами, поэтому среди современных организмов этих последовательностей больше нет.

Но генетическое родство позволяет частично восстановить эту потерянную библиотеку.

Можно сравнить древние и современные версии, определить, какие изменения усиливали определённую функцию, а затем использовать эти закономерности при проектировании новых молекул.

В этом смысле исследователи обращаются к эволюции не как к музею прошлого, а как к гигантскому естественному эксперименту.

Антимикробные пептиды тоже не защищены от устойчивости

Есть ещё одно важное ограничение.

Иногда антимикробные пептиды представляют как решение, против которого бактериям будет значительно сложнее выработать устойчивость. Исследование не даёт оснований считать их неуязвимыми.

Бактерии эволюционируют и в ответ на такие молекулы.

Поэтому потенциальная ценность подхода заключается не в поиске оружия, к которому сопротивление невозможно в принципе, а в более глубоком понимании взаимодействия между микробом и защитными молекулами хозяина.

Если исследователи смогут понять, какие структурные изменения усиливают действие пептида и какими способами бактерии ему противостоят, это может помочь проектировать комбинации или новые варианты молекул, для которых развитие устойчивости будет сложнее.

Эволюция становится инструментом разработки лекарств

Работа показывает более широкий принцип современной биологии.

Изучая последовательности современных организмов, исследователи могут не только реконструировать историю жизни. Они способны экспериментально возвращать отдельные молекулярные этапы этой истории и проверять их свойства.

В результате прошлое превращается в источник вариантов, которых больше нет в современной природе.

Для фармакологии это особенно интересно там, где существующие лекарства постепенно теряют эффективность.

Реконструированный лактоферрицин пока не является кандидатом, который можно завтра отправить в клинические испытания. Но исследование показывает другой путь: вместо случайного перебора молекул можно посмотреть, какие решения уже возникали и менялись в ходе миллионов лет эволюционного противостояния хозяев и микробов.