Препараты блокируют WEE1, чтобы уничтожить опухоль. Почему страдают здоровые клетки?

Учёные обнаружили у противораковой мишени WEE1 неожиданную вторую функцию, которая может объяснить токсичность перспективных препаратов и помочь сделать лечение более избирательным.

Один и тот же белок может работать и как тормоз, и как разрешение на движение. Всё зависит от того, на каком этапе клеточного цикла он действует.

Именно эту двойную роль фермента WEE1 обнаружила международная группа исследователей из MRC Laboratory of Medical Sciences, Оксфордского университета и University College London под руководством Алексис Барр.

Результат оказался неожиданным даже для самих авторов. Он противоречил математической модели, построенной на основании десятилетий исследований клеточного деления.

Почему раковые клетки становятся зависимыми от WEE1

Каждая клетка перед делением должна проверить состояние своей ДНК. Ошибки копирования или повреждения генетического материала могут привести к появлению опасных мутаций, поэтому в клеточном цикле существует несколько контрольных точек.

Один из главных защитных механизмов связан с белком p53. При обнаружении повреждений он способен остановить продвижение клетки по циклу, предоставив время для восстановления ДНК или запустив программу клеточной гибели.

Однако примерно в половине злокачественных опухолей функция p53 нарушена. Часто причиной становятся мутации гена TP53, кодирующего этот белок.

Такие раковые клетки могут продолжать размножение, несмотря на повреждения генетического материала.

Здесь появляется WEE1 — фермент из группы протеинкиназ, который регулирует активность других белков путём присоединения к ним фосфатных групп.

WEE1 подавляет активность фермента CDK1, не позволяя клетке преждевременно перейти к митозу — непосредственному разделению на две дочерние клетки. Это особенно важно на заключительном этапе подготовки к делению, когда необходимо убедиться, что ДНК скопирована правильно.

Для опухолевых клеток с неработающим p53 этот дополнительный контроль может оказаться критически важным.

Отсюда возникла идея противораковой терапии: если заблокировать WEE1, опухолевая клетка потеряет ещё один защитный механизм и может приступить к делению с повреждённой или не полностью скопированной ДНК. Результатом способна стать её гибель.

Такой подход называют синтетической летальностью — одновременное нарушение двух защитных механизмов оказывается губительным для клетки, хотя нарушение каждого по отдельности может быть совместимо с её выживанием.

На этом принципе основана разработка ингибиторов WEE1, включая adavosertib (AZD1775), изучавшийся в клинических исследованиях.

Но возникла проблема: препараты воздействуют не только на опухоли.

Почему перспективные ингибиторы WEE1 вызывают серьёзные побочные эффекты

Клинические испытания ингибиторов WEE1 выявили значительные ограничения, связанные с переносимостью лечения.

Среди нежелательных явлений наблюдались нарушения кроветворения, снижение количества клеток крови, желудочно-кишечные расстройства и выраженная утомляемость.

Например, в исследовании фазы Ib, включавшем 80 пациентов с распространёнными солидными опухолями в когортах расширения, диарея на фоне адавоцертиба отмечалась у 56,3% участников, тошнота — у 42,5%, а связанные с лечением нежелательные явления третьей степени тяжести и выше — у 32,5%.

Из-за токсичности некоторым пациентам приходилось прерывать лечение, снижать дозировку или полностью прекращать терапию.

Ряд программ клинической разработки ингибиторов WEE1 также столкнулся с приостановками или прекращением испытаний.

Первоначально часть нежелательных эффектов пытались объяснить недостаточной избирательностью препаратов, в частности возможным воздействием на другие ферменты, такие как PLK1.

Однако исследователи предположили альтернативное объяснение: возможно, WEE1 выполняет в здоровых клетках ещё одну важную функцию, которую ранее недооценивали.

Чтобы проверить эту гипотезу, они решили изучить работу WEE1 на гораздо более раннем этапе клеточного цикла.

Эксперимент, в котором компьютерная модель оказалась неправильной

Клеточный цикл включает несколько последовательных стадий.

В фазе G1 клетка готовится к копированию ДНК. В фазе S происходит само копирование. Далее следует G2 — подготовка к делению и дополнительные проверки, после чего начинается митоз.

Кроме того, клетка может временно находиться в состоянии покоя, обозначаемом G0, и позднее возвращаться к размножению.

До нового исследования считалось, что подавление WEE1 должно облегчать переход клетки к копированию ДНК, поскольку WEE1 тормозит активность CDK2 — одного из ферментов, управляющих началом S-фазы.

Учёные построили математическую модель известных взаимодействий между регуляторами клеточного цикла.

Модель предсказывала вполне логичный результат: снижение активности WEE1 должно раньше активировать CDK2 и ускорять начало копирования ДНК.

Затем исследователи проверили предсказание экспериментально.

Они временно остановили деление культивируемых человеческих клеток, после чего позволили им вернуться в клеточный цикл. Одновременно часть клеток подвергали воздействию ингибитора WEE1.

С помощью флуоресцентных маркеров и покадровой микроскопии исследователи отслеживали активность регуляторных белков и момент начала копирования ДНК.

Результат оказался противоположным прогнозу.

Хотя CDK2 действительно активировался раньше и сильнее, клетки не начинали копирование ДНК быстрее.

Напротив, переход к S-фазе задерживался. Некоторые клетки вообще не приступали к копированию ДНК за 48 часов наблюдения.

Аналогичные эффекты наблюдались, когда WEE1 подавляли генетическими методами или удаляли сам белок из клетки. Это помогло исключить объяснение, связанное исключительно с побочным действием конкретного ингибитора.

Получалось, что известная модель регуляции клеточного цикла была неполной.

WEE1 должен был выполнять дополнительную функцию, без которой повышение активности CDK2 не позволяло клетке начать нормальное размножение.

Неожиданная роль WEE1: клеточный тормоз оказался ещё и пусковым механизмом

Ключ к объяснению исследователи нашли в белковом комплексе APC/C-CDH1.

Этот комплекс участвует в регулируемом уничтожении белков внутри клетки. Он относится к убиквитинлигазам — молекулярным системам, которые помечают определённые белки для последующего разрушения протеасомами, клеточными структурами утилизации.

В начале клеточного цикла APC/C-CDH1 ограничивает накопление ряда белков, необходимых для подготовки к копированию ДНК.

Среди них находятся CDC6 и CDC25A.

CDC6 помогает подготовить участки ДНК, с которых начинается репликация. CDC25A участвует в активации регуляторов, необходимых для перехода к S-фазе.

Чтобы клетка могла приступить к копированию генетического материала, активность APC/C-CDH1 должна снизиться.

И здесь обнаружилась ранее недооценённая роль WEE1.

Исследователи показали, что WEE1 способен непосредственно фосфорилировать белок CDH1, который необходим для работы комплекса APC/C-CDH1.

Биохимический анализ выявил два важных участка такого воздействия — аминокислотные остатки тирозина в положениях 91 и 130.

Их фосфорилирование ослабляет взаимодействие CDH1 с комплексом APC/C, снижая активность системы удаления белков.

В результате необходимые для запуска репликации молекулы получают возможность накапливаться.

Таким образом, WEE1 не только задерживает клеточное деление на позднем этапе, но и помогает клетке успешно пройти более раннюю контрольную точку.

Комплекс APC/C-CDH1 продолжает уничтожать регуляторные белки, и переход к S-фазе становится затруднённым.

Что происходит с клеткой, которой всё-таки удалось начать копирование ДНК

Последствия блокировки WEE1 не ограничивались задержкой начала S-фазы.

Учёные обнаружили, что у клеток, которым удалось перейти к копированию ДНК, этот процесс также протекал ненормально.

В частности, нарушалась подготовка участков начала репликации, а внутри клеток накапливался белок p21.

В нормальных условиях p21 участвует в торможении клеточного цикла и помогает предотвращать опасное размножение клеток с повреждениями.

Во время S-фазы его количество обычно снижается, чтобы копирование ДНК могло происходить эффективно.

Однако после подавления WEE1 исследователи наблюдали аномальное накопление p21 непосредственно во время репликации.

Это сопровождалось признаками повреждения ДНК и последующей остановкой клеточного цикла в состоянии, напоминающем фазу G2.

Причём некоторые клетки прекращали продвижение по циклу, так и не завершив копирование всей ДНК.

Когда исследователи удаляли p21, такая поздняя остановка становилась менее выраженной, но клетки чаще погибали после воздействия ингибитора WEE1.

Получается, что p21 способен одновременно ограничивать действие препарата и защищать клетку от гибели.

Для противоопухолевой терапии это особенно интересное обстоятельство.

Почему открытие может объяснить повреждение здоровых тканей

В организме существуют ткани, которые постоянно нуждаются в образовании новых клеток.

К ним относятся костный мозг, обеспечивающий производство клеток крови, и эпителий кишечника, который регулярно обновляется.

Их нормальная работа зависит от того, насколько успешно клетки-предшественники и стволовые клетки могут переходить из состояния покоя к размножению.

Если ингибиторы WEE1 мешают такому переходу, это потенциально способно нарушать обновление здоровых тканей.

Например, недостаточное образование клеток крови может способствовать развитию анемии и других гематологических осложнений. Нарушение обновления кишечного эпителия теоретически может участвовать в развитии желудочно-кишечной токсичности.

Именно такой механизм рассматривают авторы исследования.

Здесь, однако, необходимо важное уточнение.

Работа Nature показала клеточные механизмы, способные объяснить некоторые побочные эффекты ингибиторов WEE1. Но исследователи не доказали, что именно этот механизм вызывает осложнения у пациентов.

Реальная токсичность противоопухолевых препаратов может иметь несколько причин, включая воздействие на другие молекулярные мишени и нарушения репликации ДНК.

Новая работа добавляет к этим объяснениям ещё один биологически обоснованный механизм.

Ингибиторы WEE1: какие опухоли могут оказаться наиболее чувствительными

Наиболее практическая часть исследования связана с возможностью заранее определять опухоли, чувствительные к блокировке WEE1.

Первоначально главными кандидатами считались опухоли с нарушенной функцией p53.

Но клинические и экспериментальные данные показывают, что эффективность ингибиторов WEE1 не обязательно ограничивается такими случаями.

Авторы Nature обнаружили ещё два потенциально важных признака.

Первый — снижение активности системы APC/C-CDH1.

Второй — недостаток белка p21, который кодируется геном CDKN1A.

В экспериментах клетки с уменьшенной активностью APC/C-CDH1 становились чувствительнее к ингибированию WEE1.

Похожий эффект наблюдался при удалении p21.

Например, в экспериментальной модели нормальных клеток эпителия мочевого пузыря без p21 концентрация ингибитора WEE1, необходимая для уменьшения жизнеспособности клеточной популяции наполовину, оказалась приблизительно вдвое ниже, чем в контрольных клетках.

Это указывает на возможность более точного выбора опухолей для терапии.

Особый интерес представляют опухоли мочевого пузыря, в которых иногда встречаются мутации CDKN1A, приводящие к утрате функции p21.

Авторы даже рассматривают гипотезу о возможности воздействовать на предопухолевые клеточные популяции с такими мутациями.

Однако это пока экспериментальное направление, а не доказанная стратегия профилактики рака.

Почему устойчивые клетки тоже теряли p21 и компоненты APC/C-CDH1

В работе обнаружилось ещё одно интересное противоречие.

При кратковременном подавлении p21 или APC/C-CDH1 клетки становились чувствительнее к ингибитору WEE1.

Но когда исследователи создали клетки рака молочной железы MCF7, приобретшие устойчивость к длительному воздействию препарата, они обнаружили снижение активности генов, связанных с теми же путями.

На первый взгляд результаты кажутся несовместимыми.

Однако кратковременное воздействие и адаптация к продолжительному присутствию лекарства — принципиально разные процессы.

Клетки, которые длительное время выживают в присутствии ингибитора, могут перестраивать сразу несколько регуляторных систем.

Поэтому отсутствие p21 или низкая активность APC/C-CDH1 не могут автоматически считаться гарантией ответа опухоли на лечение.

Необходимо учитывать состояние всей регуляторной сети и способность раковых клеток приобретать устойчивость.

Именно поэтому потенциальные биомаркеры, предложенные авторами, нуждаются в проверке на опухолевых образцах и клинических данных пациентов.

Что необходимо доказать, прежде чем менять лечение рака

Исследование представляет собой фундаментальную экспериментальную работу.

Его сильная сторона — сочетание математического моделирования, наблюдений за живыми клетками, генетического подавления белков и биохимических экспериментов.

Учёные не просто обнаружили неожиданное поведение клеток. Они предложили молекулярный механизм и экспериментально проверили несколько его ключевых звеньев.

Однако существуют существенные ограничения.

Во-первых, основная часть результатов получена на культивируемых клетках. Поведение опухолей и здоровых тканей в организме пациента может быть значительно сложнее.

Во-вторых, исследование не включало клиническую проверку предложенных биомаркеров.

В-третьих, пока неизвестно, позволит ли выбор опухолей с нарушениями APC/C-CDH1 или p21 действительно снизить дозировку ингибиторов WEE1 без потери противоопухолевого эффекта.

Наконец, неизвестно, можно ли создать препараты, которые будут подавлять позднюю защитную функцию WEE1, необходимую опухолевым клеткам, но сохранять его участие в запуске репликации в здоровых тканях.

Авторы рассматривают такую возможность, однако конкретного решения пока нет.

Следующим этапом должны стать исследования на доклинических моделях, а затем проверка предсказаний на образцах опухолей и данных пациентов, участвующих в клинических испытаниях.

Если предложенные биомаркеры подтвердят свою прогностическую ценность, они могут помочь онкологам точнее определять, каким пациентам потенциальная польза ингибиторов WEE1 будет оправдывать риск нежелательных эффектов.