Антибиотик помог опасной кишечной бактерии создавать более устойчивые споры

Учёные обнаружили, как ген антибиотикорезистентности позволяет Clostridioides difficile переживать нагревание и обработку дезинфицирующими средствами

В больнице можно тщательно обработать поверхность дезинфицирующим средством, но на ней всё равно могут остаться жизнеспособные бактериальные споры. Они не размножаются, не питаются и способны долго сохраняться в неблагоприятных условиях.

Особенно опасны такие споры, когда речь идёт о Clostridioides difficile — одном из наиболее значимых возбудителей инфекционной диареи в медицинских учреждениях.

До недавнего времени устойчивость бактерий к антибиотикам и устойчивость их спор к внешним воздействиям рассматривали преимущественно как разные биологические свойства.

Исследование международной группы под руководством специалистов Университета Монаша в Австралии обнаружило неожиданную связь между ними.

Оказалось, что ген, помогающий бактерии противостоять действию определённых антибиотиков, способен одновременно менять процесс образования спор. Причём получившиеся споры отличаются от обычных не только строением, но и способностью переживать экстремальные условия.

Почему Clostridioides difficile так трудно уничтожить

Clostridioides difficile, или C. difficile, — бактерия, способная вызывать воспаление толстой кишки. Заболевание обычно сопровождается диареей, но в тяжёлых случаях может приводить к опасным осложнениям.

Особенность этой инфекции заключается в её связи с антибиотиками.

В норме кишечник населён множеством микроорганизмов, которые конкурируют между собой за питательные вещества и пространство. Такое микробное сообщество препятствует чрезмерному размножению потенциально опасных бактерий.

Антибиотики способны нарушать это равновесие.

Когда часть нормальной кишечной микробиоты погибает, C. difficile получает возможность активно размножаться. Некоторые её штаммы выделяют токсины, повреждающие слизистую оболочку кишечника.

Наиболее уязвимы пожилые люди, пациенты после длительного лечения антибиотиками и люди с тяжёлыми сопутствующими заболеваниями.

Но главная сложность заключается в том, что C. difficile существует в двух принципиально разных состояниях.

Первое — обычная, или вегетативная, бактериальная клетка. Она активно живёт, размножается и может производить токсины.

Второе — спора.

Спора представляет собой особую покоящуюся форму бактерии, защищённую несколькими оболочками. В таком состоянии её обмен веществ практически останавливается, а устойчивость к неблагоприятным условиям резко возрастает.

Споры способны сохраняться на предметах, медицинском оборудовании и других поверхностях. Попав в подходящую среду, они могут прорастать, вновь превращаясь в активные бактериальные клетки.

Антибиотик блокировал производство спор, но не у всех бактерий

Австралийские исследователи начали с уже известного механизма.

Ранее было установлено, что некоторые антибиотики из группы цефамицинов способны подавлять образование спор C. difficile.

Один из таких препаратов — цефотетан.

Его действие связано с бактериальным белком SpoVD, который участвует в построении защитного слоя споры.

Этот слой содержит пептидогликан — прочную молекулярную структуру, состоящую из связанных между собой углеводных цепей и коротких пептидов.

Чтобы сформировать полноценную спору, бактерии необходимо правильно построить этот защитный каркас.

Белок SpoVD выполняет одну из ключевых операций: помогает соединять компоненты пептидогликана.

Цефотетан связывается с SpoVD и подавляет его активность.

В результате бактерия теряет возможность нормально завершить образование спор.

Однако исследователи заметили, что этот механизм работает не у всех штаммов C. difficile.

Некоторые продолжали производить споры даже в присутствии антибиотика.

Возник вопрос: каким образом бактерия сохраняет способность строить споры, если важнейший белок этого процесса заблокирован?

Бактерия нашла замену заблокированному белку

Ответ оказался связан с геном CdmecA.

Этот ген кодирует белок CdMecA, который способен выполнять часть работы, обычно осуществляемой SpoVD.

Самое интересное заключается в происхождении механизма.

CdMecA родственен белку MecA, хорошо известному исследователям антибиотикорезистентности.

У золотистого стафилококка Staphylococcus aureus родственный белок PBP2a помогает обеспечивать устойчивость к определённым бета-лактамным антибиотикам. Именно такой механизм имеет большое значение для метициллин-резистентного золотистого стафилококка — MRSA.

У C. difficile исследователи обнаружили другое применение похожего молекулярного инструмента.

В присутствии цефотетана бактерия, обладающая соответствующим генетическим механизмом, увеличивает производство CdMecA.

Этот белок гораздо хуже связывается с цефотетаном, поэтому сохраняет активность там, где обычный SpoVD уже заблокирован.

В результате образование спор продолжается.

Фактически бактерия использует альтернативный способ выполнения той же биохимической операции.

При этом механизм оказался несколько сложнее простой замены одного белка другим.

Исследователи обнаружили, что CdMecA взаимодействует с заблокированным SpoVD и работает совместно с другим белком — SpoVE.

По предложенной авторами модели, SpoVD даже после потери ферментативной активности сохраняет структурную роль в белковом комплексе, необходимом для построения оболочки споры.

Получается необычная ситуация: антибиотик выключает важный фермент, но бактерия использует его сохранившуюся структуру вместе с альтернативным белком, чтобы продолжить работу.

Эту модель подтверждают несколько экспериментальных подходов, хотя отдельные детали молекулярного механизма ещё требуют проверки.

Самое неожиданное — новые споры оказались выносливее обычных

На этом исследование могло бы закончиться обнаружением ещё одного механизма антибиотикорезистентности.

Но учёные решили проверить, отличаются ли споры, сформированные с участием CdMecA, от обычных спор.

Для этого они получили две группы спор одного штамма C. difficile.

В первой группе споры формировались обычным путём, с участием SpoVD.

Во второй — в присутствии цефотетана, когда в построении спор участвовал альтернативный белок CdMecA.

Затем споры подвергали воздействию высокой температуры и хлорсодержащего средства.

Различия оказались существенными.

При нагревании до 75 °C в течение 30 минут жизнеспособность сохранили:

• 97% спор, сформированных с участием CdMecA;
• 75% обычных спор.

При температуре 100 °C в течение 10 минут:

• 51% спор CdMecA сохранили жизнеспособность;
• 22% обычных спор пережили обработку.

Ещё заметнее различия проявились при воздействии отбеливателя.

После десятиминутной обработки раствором с концентрацией 2,5%:

• 36% спор CdMecA сохранили способность образовывать колонии;
• среди обычных спор жизнеспособных в этом эксперименте не обнаружили.

Таким образом, различия касались не только устойчивости к антибиотику, но и способности спор переживать физические и химические воздействия.

Здесь необходимо важное уточнение.

Исследователи использовали контролируемые лабораторные условия, а не проверяли эффективность всех существующих больничных дезинфицирующих средств.

Поэтому результаты не означают, что современные методы дезинфекции перестали работать.

Однако они показывают, что генетические особенности бактерии могут существенно влиять на устойчивость её спор к обработке.

Почему более тонкая оболочка оказалась связана с большей устойчивостью

Исследователи попытались разобраться, почему новые споры лучше выдерживают неблагоприятные условия.

С помощью электронной микроскопии они изучили строение защитного слоя спор.

Результат оказался неожиданным.

У спор, сформированных с участием CdMecA, толщина внутреннего защитного слоя — кортекса — была примерно на 8% меньше, чем у обычных.

На первый взгляд это противоречит полученным данным.

Казалось бы, более тонкий защитный слой должен хуже предохранять бактерию от нагревания и химических воздействий.

Но устойчивость спор определяется не только толщиной оболочки.

Исследователи обнаружили различия в содержании комплекса кальция с дипиколиновой кислотой — Ca-DPA.

Это вещество играет важную роль в свойствах бактериальных спор, включая их устойчивость к стрессовым условиям.

В спорах CdMecA содержание Ca-DPA оказалось выше.

Авторы предполагают, что именно изменение внутреннего химического состава может частично объяснять повышенную выносливость.

При этом более тонкий кортекс потенциально способен облегчать последующее прорастание споры.

Эксперименты подтвердили ещё одну особенность: при воздействии таурохолата — вещества, стимулирующего прорастание спор C. difficile, — споры CdMecA начинали прорастать быстрее.

Особенно заметные различия наблюдались в первые восемь минут эксперимента.

Получается, что исследователи обнаружили сразу несколько изменений: споры лучше переносили некоторые неблагоприятные воздействия и быстрее выходили из покоя при подходящих условиях.

Пока неизвестно, насколько эти свойства повышают вероятность заражения человека в реальных условиях.

Но с биологической точки зрения сочетание повышенной устойчивости и ускоренного прорастания заслуживает особого внимания.

Ген устойчивости обнаружили почти в каждом десятом изученном геноме

Следующий вопрос заключался в распространённости обнаруженного механизма.

Исследователи проанализировали 10 330 общедоступных геномов C. difficile, представляющих различные эволюционные группы бактерии.

Ген CdmecA обнаружили в 9,8% изученных геномов.

Однако его распространённость сильно различалась между генетическими группами.

Например, среди исследованных геномов группы Clade 5 он встречался в 55,5% случаев, а в Clade 4 — в 40,8%.

Это свидетельствует о неравномерном распределении механизма устойчивости между бактериальными линиями.

Важно понимать, что речь идёт об анализе доступных геномных последовательностей, а не о репрезентативном обследовании пациентов.

Поэтому показатель 9,8% нельзя автоматически интерпретировать как долю всех инфекций C. difficile, вызванных бактериями с этим геном.

Кроме того, исследователи обнаружили родственные гены у других спорообразующих микроорганизмов.

В частности, они экспериментально подтвердили способность CdMecA частично восстанавливать образование спор в присутствии цефотетана у Clostridium perfringens — бактерии, способной вызывать кишечные инфекции и другие заболевания.

Это позволяет предположить, что обнаруженный механизм не ограничивается одним видом микроорганизмов.

Но насколько широко он работает в природе и каким образом соответствующие гены распространяются между бактериями, ещё предстоит установить.

Можно ли заблокировать оба механизма одновременно

Обнаружение альтернативного белка позволило исследователям проверить потенциальный способ преодоления устойчивости.

Логика эксперимента была следующей.

Если цефотетан блокирует SpoVD, но бактерия использует вместо него CdMecA, можно попробовать одновременно воздействовать на оба белка.

Для этого исследователи испытали сочетание цефотетана с цефтобипролом — антибиотиком, способным взаимодействовать с белками семейства MecA.

В лабораторных культурах каждый препарат по отдельности не обеспечивал значительного подавления образования спор у изученного устойчивого штамма.

Но при совместном применении образование спор снижалось до уровня ниже предела обнаружения используемого метода.

Аналогичный эффект исследователи получили при сочетании цефотетана с цефтаролином.

Таким образом, эксперимент подтвердил принципиальную возможность одновременно перекрыть основной и альтернативный пути образования спор.

Однако это пока лабораторный результат.

Исследование не было клиническим испытанием, не оценивало эффективность таких комбинаций у пациентов и не доказывало, что их применение предотвращает рецидивы инфекции.

Кроме того, подавление образования новых спор не означает автоматического уничтожения уже сформировавшихся.

Поэтому предложенный подход следует рассматривать как направление дальнейшей разработки, а не готовую схему лечения.

Что открытие меняет для больниц и пациентов

Результаты исследования затрагивают две взаимосвязанные проблемы: антибиотикорезистентность и инфекционный контроль.

Обычно, когда говорят об устойчивости бактерий к антибиотикам, подразумевают способность микроорганизмов продолжать размножаться, несмотря на лечение.

Но у спорообразующих бактерий существует ещё одна важная задача — пережить период, когда условия для активного существования неблагоприятны.

Новое исследование показывает, что генетический механизм защиты от антибиотика может одновременно изменять свойства этой покоящейся формы.

Для больниц это означает необходимость учитывать не только чувствительность активных бактериальных клеток к лекарствам, но и особенности образования и сохранения спор.

Однако оснований для отказа от действующих методов профилактики нет.

Для предупреждения распространения C. difficile по-прежнему важны:

• Рациональное назначение антибиотиков, поскольку нарушение кишечной микробиоты увеличивает риск инфекции.
• Мытьё рук водой с мылом, особенно после контакта с пациентами и потенциально загрязнёнными поверхностями.
• Использование дезинфицирующих средств с подтверждённой спороцидной активностью и соблюдение инструкций по их применению.
• Контактные меры предосторожности в медицинских учреждениях, включая перчатки и защитную одежду.
• Правильная обработка загрязнённых поверхностей, оборудования и белья.

Обычные спиртовые антисептики не обеспечивают надёжного уничтожения спор C. difficile. Поэтому в ситуациях риска особенно важно сочетание надлежащей гигиены рук и специальных противоэпидемических мер.

Для пациентов принципиально другое: обнаруженный механизм не означает, что существующее лечение C. difficile стало неэффективным.

В клинической практике применяются специальные схемы терапии, в том числе с фидаксомицином или ванкомицином. Выбор зависит от тяжести заболевания, наличия рецидивов и индивидуальных факторов риска.

Новая работа не даёт оснований самостоятельно менять назначенное лечение.

Чего исследование пока не доказало

Несмотря на убедительные молекулярные и лабораторные результаты, у работы есть существенные ограничения.

Во-первых, повышенная устойчивость спор была продемонстрирована в определённых экспериментальных условиях.

Во-вторых, споры, образованные с участием CdMecA, сравнивали с обычными спорами, полученными без воздействия цефотетана. Поэтому наблюдаемые различия характеризуют весь альтернативный путь спорообразования в условиях эксперимента, а не обязательно изолированный эффект одного белка.

В-третьих, исследователи не установили, приводит ли наличие CdmecA к увеличению числа заражений, более тяжёлому течению заболевания или повышенной частоте рецидивов у пациентов.

Сами авторы отмечают, что обнаруженный ген пока не связан с доказанным увеличением клинического бремени инфекции.

Наконец, неизвестно, насколько результаты лабораторных испытаний устойчивости спор соответствуют их поведению при различных режимах профессиональной дезинфекции и стирки.

Следующим этапом должны стать исследования клинических изолятов, реальных условий передачи инфекции и безопасности потенциальных методов блокирования спорообразования.