Т-клетки из пуповинной крови научили атаковать опухоль двумя способами

Экспериментальная технология UCLA может превратить персональную клеточную терапию в заранее приготовленное лекарство

Почему клеточную терапию нельзя просто достать из холодильника

Современная клеточная иммунотерапия построена на необычной идее: лекарством становится живая иммунная клетка.

У пациента получают Т-лимфоциты, генетически изменяют их так, чтобы они узнавали опухоль, размножают в лаборатории и возвращают человеку. Именно этот принцип лежит в основе CAR-T и TCR-T-терапии.

Но здесь возникает производственная проблема. Многие существующие технологии требуют индивидуального изготовления препарата из клеток конкретного пациента. Это занимает время, качество исходных клеток различается, а производство остается сложным и дорогостоящим.

Для человека с быстро прогрессирующим раком несколько недель ожидания — совсем не абстрактная технологическая деталь.

Логичное решение кажется очевидным: взять клетки здорового донора, произвести большую партию заранее, заморозить ее и выдавать дозу по необходимости.

Но иммунная система устроена так, что чужие Т-клетки могут оказаться опасными. Их собственные рецепторы способны распознать ткани получателя как чужеродные и вызвать реакцию «трансплантат против хозяина» — реакцию отторжения, или GvHD.

Исследователи UCLA попытались решить проблему иначе: начать производство не со зрелой донорской Т-клетки, а гораздо раньше — со стволовой клетки крови.

Т-клетку запрограммировали еще до того, как она стала Т-клеткой

Команда использовала CD34-положительные кроветворные стволовые и прогениторные клетки из донорской пуповинной крови.

В них внесли ген рецептора, распознающего NY-ESO-1 — так называемый раково-тестикулярный антиген. Он аномально экспрессируется при ряде злокачественных опухолей, включая меланому и некоторые опухоли яичника, легкого и мягких тканей, но почти отсутствует в обычных соматических тканях.

После генетической модификации исследователи направляли стволовые клетки по пути развития в Т-лимфоциты.

Именно последовательность этих действий имеет принципиальное значение.

Обычная зрелая Т-клетка уже обладает собственным уникальным Т-клеточным рецептором — TCR. Если поверх него добавить новый противоопухолевый рецептор, появляется нежелательная смесь рецепторов и риск неправильного распознавания.

Здесь противоопухолевый TCR появился раньше, во время формирования будущей Т-клетки. В результате механизм, называемый аллельным исключением, препятствовал формированию дополнительного собственного рецептора.

Одноклеточное секвенирование TCR показало, что в полученном продукте 100% исследованных клеток несли заданный ESO-TCR, а обнаруживаемых эндогенных TCR не было.

Получился практически однотипный отряд клеток, запрограммированный на одну основную мишень.

TCR видит то, чего CAR-T обычно не видит

Здесь есть еще одно важное отличие от хорошо известных CAR-T-клеток.

CAR распознает молекулу непосредственно на поверхности опухолевой клетки. Это прекрасно работает, когда подходящая мишень действительно находится снаружи клетки, как происходит с CD19 при некоторых опухолях крови.

Для многих солидных опухолей найти такую удобную поверхностную мишень значительно сложнее.

TCR работает иначе.

Белки внутри клетки постоянно расщепляются на небольшие фрагменты — пептиды. Часть этих фрагментов молекулы HLA выносят на поверхность клетки, словно выставляя образцы внутреннего содержимого для проверки иммунной системой.

Поэтому TCR способен косвенно «заглянуть внутрь» опухолевой клетки.

В данном исследовании использовали TCR, распознающий фрагмент NY-ESO-1, представленный молекулой HLA-A2.

Это существенно расширяет потенциальный набор мишеней клеточной терапии: атаковать можно не только то, что находится на наружной оболочке опухоли, но и белки, скрытые внутри нее.

Однако здесь же находится уязвимость.

Если опухоль перестанет показывать нужный антиген или потеряет соответствующую HLA-молекулу, TCR может перестать ее видеть.

И именно здесь исследование становится особенно интересным.

У этих клеток оказался второй радар

Полученные AlloESO-T-клетки приобрели выраженные свойства, напоминающие естественные киллеры — NK-клетки.

На их поверхности присутствовали активирующие NK-рецепторы, включая NKG2D и DNAM-1. Они распознают стрессовые сигналы, которые часто появляются на опухолевых клетках.

Получается система с двумя каналами обнаружения.

Первый — высокоспецифичный TCR: NY-ESO-1 → HLA → TCR → атака.

Второй — NK-подобный: стрессовые молекулы опухоли → NKG2D/DNAM-1 → атака.

Исследователи проверили это на клеточных линиях меланомы, рака яичника и рака простаты.

Обычные TCR-T-клетки, изготовленные из зрелых клеток периферической крови, уничтожали опухолевые клетки только тогда, когда присутствовала необходимая комбинация NY-ESO-1 и HLA.

AlloESO-T могли уничтожать и некоторые клетки, лишенные соответствующей HLA-молекулы.

Когда ученые блокировали NKG2D и DNAM-1 антителами, эта дополнительная цитотоксичность заметно снижалась. Это стало функциональным подтверждением того, что второй механизм действительно участвует в уничтожении опухоли.

Главная проблема терапии — опухоль умеет исчезать с радара

Именно здесь находится «момент осознания» этой работы.

Одной из фундаментальных проблем таргетной противоопухолевой терапии является не только способность уничтожить раковую клетку. Нужно еще не позволить опухоли перестать выглядеть как мишень.

Опухоль неоднородна. Внутри нее существуют разные клеточные популяции. Если лечение уничтожает клетки с определенным антигеном, преимущество получают те, у которых этого антигена мало или нет вообще.

Это называют антигенным ускользанием.

Терапия может прекрасно работать в начале, но сама создает эволюционное давление, отбирающее клетки, которые она больше не распознает.

AlloESO-T потенциально усложняют такой побег. Потерять NY-ESO-1/HLA-сигнал может оказаться недостаточно, если клетка по-прежнему демонстрирует стрессовые признаки, распознаваемые NK-рецепторами.

Это еще не доказательство того, что у пациентов опухоль не сможет выработать устойчивость. Но именно двойное распознавание — один из наиболее интересных механистических результатов исследования.

Одна инфузия контролировала опухоли у мышей

Следующим этапом стали эксперименты in vivo.

В модели рака яичника OVCAR3 у иммунодефицитных мышей одна доза Allo15ESO-T — варианта клеток, дополнительно продуцирующего интерлейкин-15, — обеспечивала длительное подавление опухоли. Все животные этой группы прожили более 100 дней наблюдения, хотя остаточный опухолевый сигнал сохранялся.

Для сравнения использованные в эксперименте TCR-T-клетки, изготовленные из зрелых клеток периферической крови, обеспечивали лишь частичный контроль. Животные этой группы погибали примерно к 60-му дню вследствие прогрессирования заболевания и GvHD.

Похожую картину исследователи получили в модели метастатической меланомы A375. Allo15ESO-T замедляли прогрессирование и продлевали выживаемость, хотя впоследствии опухоль вновь начинала расти.

То есть речь не идет об универсальном уничтожении рака даже в экспериментальных животных.

Но поведение самих клеток оказалось примечательным.

После единственной инфузии Allo15ESO-T размножались в организме примерно в 100 раз, преимущественно перемещались к опухоли и сохранялись там неделями. В модели рака яичника их присутствие обнаруживалось более 50 дней.

Клетки сравнения, напротив, проникали в печень, легкие и другие органы и вызывали GvHD.

Почему интерлейкин-15 оказался одновременно полезным и опасным

Для длительной работы иммунной клетке недостаточно найти опухоль. Ей необходимо выжить, размножиться и не потерять функциональность.

Исследователи встроили в часть клеток ген IL-15 — интерлейкина-15, сигнального белка, поддерживающего существование и активность цитотоксических лимфоцитов.

Без IL-15 AlloESO-T хуже сохранялись в организме и не обеспечивали длительного контроля опухоли.

Но эксперимент одновременно показал важную обратную сторону такого усиления.

Когда IL-15 добавили обычным донорским TCR-T-клеткам из периферической крови, их противоопухолевая активность стала сильнее — но развилась тяжелая GvHD.

Иными словами, усилить Т-клетку недостаточно. Нужно одновременно контролировать, что именно она способна распознавать.

В Allo15ESO-T эти две задачи попытались решить вместе: IL-15 поддерживает длительную активность, а отсутствие разнообразного набора собственных TCR снижает нежелательную реактивность.

Из одного образца — потенциально тысячи доз

Вторая большая идея работы относится уже не столько к иммунологии, сколько к производству лекарств.

За примерно шесть недель культивирования из клеток одного донора пуповинной крови исследователи получали порядка 10¹² зрелых клеток. В статье авторы оценивают потенциальный выход примерно в 1 000–10 000 терапевтических доз в зависимости от необходимой дозировки.

Это принципиально другая производственная модель.

Вместо цепочки: пациент → забор клеток → индивидуальная модификация → культивирование → препарат для одного человека — может появиться схема: донорская пуповинная кровь → огромная стандартизированная партия → замораживание → готовые дозы для многих пациентов.

Авторы также приводят предварительную расчетную оценку стоимости производства около $5 000 на дозу.

Эту цифру важно воспринимать особенно осторожно. Это не цена будущего препарата и не стоимость лечения в клинической практике. Пока нет промышленного производства AlloESO-T, клинических испытаний, утвержденной дозы, коммерческой цепочки поставок и регуляторно одобренного продукта.

Но сама возможность перейти от индивидуального изготовления к серийному производству способна изменить экономику клеточной терапии.

Безопасность пока доказана только в доклинической системе

Исследователи отдельно изучали риск GvHD, иммунного отторжения клеток и синдрома высвобождения цитокинов.

Allo15ESO-T практически не реагировали на клетки восьми несовместимых доноров в лабораторном тесте и не вызывали наблюдаемой GvHD в использованных мышиных моделях. У них также были ниже некоторые показатели воспалительной реакции, связанные с синдромом высвобождения цитокинов.

Авторы пошли дальше и создали еще более модифицированный вариант клеток — UESO-T. С помощью CRISPR-Cas9 они выключили компоненты HLA класса I и II, добавили HLA-E для защиты от NK-клеток и встроили «аварийный выключатель» sr39TK, позволяющий уничтожать клетки ганцикловиром.

Это показывает модульность платформы: стволовую клетку можно программировать несколькими генетическими изменениями еще до формирования конечного Т-лимфоцита.

Но слово «безопасные» здесь пока преждевременно.

Использованные NSG-мыши имеют глубоко нарушенную иммунную систему и не воспроизводят полноценную человеческую иммунную реакцию. Сами авторы прямо предупреждают, что такая модель может недооценивать, например, риск цитокиновой токсичности.

Почему это еще не новая терапия рака

Главное ограничение исследования очень простое: ни один пациент AlloESO-T пока не получил.

Работа включает клеточные эксперименты и модели человеческих опухолей у иммунодефицитных мышей. Это необходимый этап разработки, но расстояние между успешной терапией мыши и эффективным лекарством для человека остается огромным.

Есть и более конкретные вопросы.

Во-первых, основная версия клеток направлена против NY-ESO-1. Этот антиген присутствует далеко не во всех опухолях и не у всех пациентов.

Во-вторых, TCR по-прежнему зависит от конкретного варианта HLA пациента. В основной конструкции использовался рецептор, распознающий NY-ESO-1 в комплексе с HLA-A2. Поэтому «универсальность» производства не означает, что одна и та же клеточная партия подойдет любому человеку с любым HLA.

Авторы показали, что платформу можно адаптировать и к другому варианту HLA — HLA-B7, — и предлагают в будущем создавать библиотеку готовых TCR-T-продуктов для разных антигенов и HLA.

В-третьих, IL-15 повышает жизнеспособность и активность клеток, но длительная автономная стимуляция иммунных клеток сама требует тщательной оценки безопасности.

Наконец, лабораторное преимущество двойного TCR/NK-распознавания еще предстоит проверить в гораздо более сложной среде настоящих человеческих опухолей.

Что действительно изменилось после этой работы

Исследование не показывает, что появился новый способ лечения всех солидных опухолей.

Оно показывает нечто более конкретное и, возможно, более фундаментальное: Т-клеточную терапию можно попытаться проектировать как промышленную платформу еще на уровне кроветворной стволовой клетки.

В одну исходную клеточную систему можно заранее встроить противоопухолевый рецептор, поддержку IL-15, дополнительные механизмы распознавания, защиту от иммунного отторжения и даже аварийный выключатель.

После этого из нее производятся огромные количества относительно стандартизированных клеток.

Если эффективность и безопасность такого подхода подтвердятся у людей, клеточная терапия сможет постепенно приблизиться к привычной фармацевтической модели — когда лекарство производится серийно, хранится замороженным и доступно тогда, когда оно понадобилось пациенту.

Пока это именно возможность, а не клиническая реальность.